菊苣、葛根、桑葉配方對高尿酸合并關(guān)節(jié)炎小鼠的降尿酸和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的干預(yù)效果

吳美音,陳淑寧,高 潔,*,裴超穎,林偉杰,陳有軍

(1.廣州宏韻醫(yī)藥科技股份有限公司,廣東廣州 510000;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東廣州 510006)

痛風(fēng)(Gout)是一種由于嘌呤代謝紊亂而導(dǎo)致人體內(nèi)尿酸過度分泌或排泄不足所引起的疾病,臨床上以痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎最為常見。在過去的幾十年里,痛風(fēng)的發(fā)病率逐年上升,且發(fā)病人群逐漸年輕化,城市和沿海地區(qū)尤甚[1-3]。因此,開展對痛風(fēng)預(yù)防和治療的研究也成為了當(dāng)前的熱點(diǎn)。目前,臨床上治療高尿酸血癥痛風(fēng)主要有別嘌呤醇等藥物,其雖能夠較快緩解痛風(fēng)癥狀,但只有不到一半的高尿酸血癥患者血清UA水平能夠得到有效控制,且肝腎損害、過敏等副作用也較為突出[4-5]。本研究主要以療效確切的菊苣、葛根和桑葉構(gòu)成配方,探究其降低尿酸水平,減輕炎癥反應(yīng)及提升安全性的效用。

菊苣(CichoriumintybusL.)為菊科植物毛菊苣或菊苣的干燥地上部分或根,是一種常見的藥食兩用中藥材。菊苣性涼而味微苦、咸,具有清肝利膽,利尿消腫之效,臨床常用于濕熱黃疸,水腫尿少之患[6]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,菊苣中主要含有酚酸類、香豆素、倍半萜等化學(xué)成分,具有降血糖、降尿酸、保肝等作用[7-9]。葛根是豆科植物野葛[Puerarialobata(Willd.)Ohwi]的干燥根,是常見的治療糖尿病及其并發(fā)癥的中藥組分[10],不僅如此,研究表明葛根能明顯緩解大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)腫脹程度,同時(shí)還具有降尿酸和修護(hù)脾、腎的作用[11]。桑葉[Mulberry(L.)leaf]為桑科植物桑的干燥葉,其含有的黃酮類成分被證明具有調(diào)節(jié)糖脂代謝異常,減輕炎癥,抑制尿酸代謝中黃嘌呤氧化酶的作用[12-14]。由此可見,這三種中藥在調(diào)節(jié)代謝,保護(hù)肝腎及抑制炎性方面相得益彰,同時(shí)上述配方屬于衛(wèi)計(jì)委公布的既是食品又是藥品的中藥,可以得到更加有效的利用。因此本課題推測三藥等配伍組方針對痛風(fēng)在降低尿酸水平,減少肝腎損傷及炎癥方面會(huì)有更好的療效,且目前尚無將上述三種藥物組方研究的相關(guān)報(bào)道。

本研究采用氧嗪酸鉀誘導(dǎo)小鼠高尿酸血癥模型和尿酸鈉誘導(dǎo)小鼠痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎模型,研究主要由菊苣、葛根及桑葉組成的組方的的降尿酸和抗痛風(fēng)作用,并進(jìn)一步探討藥物發(fā)揮功效可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種小鼠 雄性,SPF級,體質(zhì)量(20±2) g,廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號:SCXK(粵)2019-0035,廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng),許可證號:SYXK(粵)-20180084;菊苣、葛根、桑葉、余甘子、玉米須等 批號:20181015,廣州宏韻醫(yī)藥科技股份有限公司;尿酸鈉(MSU)(批號:102369021)、氧嗪酸鉀(PO)(批號:101469031)、別嘌呤醇(批號:1001767673) 美國Sigma化學(xué)公司;組方固體飲料 批號:20181015,廣州宏韻醫(yī)藥科技股份有限公司,主要配方:菊苣、葛根、桑葉等;羧甲基纖維素鈉(sodium carboxyl methyl cellulose,CMC-Na) 批號:201424,上海麥克林公司;尿酸(UA)試劑盒(批號:20181025)、黃嘌呤氧化酶(XOD)試劑盒(批號:20181023)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒(批號:20181021)、谷丙轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(批號:20181021)、肌酐(CRE)試劑盒(批號:20180928)、尿素氮(BUN)試劑盒(批號:20180927) 以上生化試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1510型全波長酶標(biāo)儀、Fresco 70型冷凍高速離心機(jī) 德國Thermo Fisher公司;OLYMPUS光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴公司;核酸電泳儀 Bio-rad公司;BS300型紅外溫度計(jì) 中科紅外科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型復(fù)制、分組及給藥方法 將50只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為5組,每組10只,即空白組、模型組、別嘌醇陽性組(5 mg·kg-1)、配方高、低劑量組(2.67、1.33 g·kg-1),動(dòng)物以每日12 h光照,相對濕度50%～80%,應(yīng)用消毒水和標(biāo)準(zhǔn)飼料嚴(yán)格飼養(yǎng);每日先造模,造模是以PO誘導(dǎo)高尿酸,連續(xù)腹腔注射15 d(0.25 g·kg-1);其中空白組注射等劑量溶劑0.5% CMC-Na;自第9 d起每兩日關(guān)節(jié)腔注射一次尿酸鈉(25 mg·mL-1尿酸鈉晶體混懸液),以誘導(dǎo)小鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。造模完成后各組每日灌胃上述劑量藥物,空白組及模型組給予等容積的蒸餾水,連續(xù)15 d。

1.2.2 血清代謝及炎癥因子指標(biāo)檢測 在實(shí)驗(yàn)的第15 d晚上,小鼠禁食過夜;第16 d早上小鼠吸入乙醚麻醉,以含有EDTA真空采血管自下腔靜脈采血。全血于3500 r·min-1(-4 ℃)低溫離心15 min,分離血清。按試劑盒說明測定血清中UA及XOD、AST及ALT、CRE及BUN、IL-1β及TNF-α的水平。

1.2.3 小鼠關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)及腫脹度檢查 自第9 d起,關(guān)節(jié)腔注射尿酸鈉后,每日采用紅外溫度計(jì)拍攝腫脹關(guān)節(jié)的溫度,并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算炎癥指數(shù)。其標(biāo)準(zhǔn)如下:0級踝關(guān)節(jié)正常,局部皮膚顏色及膚溫未見明顯改變(10分);Ⅰ級踝關(guān)節(jié)表面紅斑,關(guān)節(jié)輕度腫脹踝關(guān)節(jié)骨性標(biāo)志清晰可見(8分);Ⅱ級踝關(guān)節(jié)明顯腫脹,局部顏色稍紅,踝關(guān)節(jié)骨性標(biāo)志模糊,踝關(guān)節(jié)腫脹范圍僅限于踝關(guān)節(jié)局部(4分);Ⅲ級踝關(guān)節(jié)局部腫脹且踝關(guān)節(jié)以外部位肢體出現(xiàn)腫脹(0分)。第16 d用游標(biāo)卡尺測量小鼠雙足關(guān)節(jié)的最大直徑并計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度。注:為了盡量保證測量的準(zhǔn)確性,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均由同1個(gè)人操作,每組重復(fù)測量3次并求取平均值。關(guān)節(jié)腫脹度=(小鼠右膝關(guān)節(jié)周徑-左膝關(guān)節(jié)周徑)/左膝關(guān)節(jié)周徑。

1.2.4 肝臟、腎臟及關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察 第16 d采血完成后,動(dòng)物麻醉后頸部脫臼處死,解剖其肝臟、腎臟及腫脹關(guān)節(jié),肝腎精密稱重后,取一小塊快速用4%的多聚甲醛溶液固定,關(guān)節(jié)直接固定,其余肝腎組織凍存;肝腎組織固定48 h后使用系列乙醇脫水,用石蠟包埋,而后切成4 μm石蠟切片,石蠟烘干后用蘇木精和伊紅進(jìn)行病理染色。關(guān)節(jié)組織則先進(jìn)行脫鈣處理,后續(xù)實(shí)驗(yàn)流程與肝腎組織的流程一致。各組織病理均用光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS,Japan)200×放大觀察并拍照。

1.2.5 腎臟尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(URAT1)的檢查 各組取約50 mg腎臟組織于1 mL EP管中,裂解液與蛋白酶抑制劑按1∶100比例配制,各EP管加入300 μL配制溶液后勻漿。勻漿經(jīng)充分裂解后于4500 r·min-1(-4 ℃)離心機(jī)低溫離心15 min,分離上清后取微量上清液稀釋20倍用碧云天的BCA試劑盒測定各組蛋白濃度,蛋白樣品和加樣緩沖液于4∶1的比例混合后高溫煮8 min至蛋白變性。蛋白提取完成后,分裝至-20 ℃保存待用。而后使用康為的配膠試劑盒配置8%和10%的SDS-PAGE電泳凝膠,各組蛋白樣品上樣后在凝膠中分離,而后300 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h。轉(zhuǎn)膜完成后,將膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉,經(jīng)TBS-Tween洗滌3次后,URAT1抗體按1∶1000稀釋后進(jìn)行孵育,4 ℃過夜。第2 d,用TBS-Tween洗滌3次后在室溫下用二抗孵育1 h,洗滌后用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色,拍照并使用Image J軟件進(jìn)行密度分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般狀況評價(jià)

尿酸鈉造模前,各組小鼠皮毛有光澤,精神狀態(tài)良好,活動(dòng)性好,攝食攝水正常,體重增加;進(jìn)行尿酸鈉造模干預(yù)后,模型組各組小鼠出現(xiàn)毛色變黃,光澤度降低,攝食量減少,右踝關(guān)節(jié)局部皮膚溫度增高,小鼠不喜動(dòng)。另外,各組動(dòng)物關(guān)節(jié)造模后踝關(guān)節(jié)腫脹,除正常組外,其余各組動(dòng)物因動(dòng)物個(gè)體差異,造模后有1～2只小鼠關(guān)節(jié)腫脹后發(fā)炎,表現(xiàn)出不喜動(dòng),后期甚至不進(jìn)食,而后導(dǎo)致死亡。

2.2 組方對小鼠血清中UA、XOD水平的影響

由表1，圖1和圖2可知，與正常組比較,模型組血清UA、XOD水平,腎臟URAT1蛋白表達(dá)極顯著升高(P<0.01),提示高尿酸模型造模成功;與模型組比較,組方高、低劑量組的UA、XOD水平極顯著降低(P<0.01),URAT1蛋白水平也顯著下降(P<0.05)。

表1 組方對小鼠血清中UA、XOD含量的影響Table 1 Effects of component on serum UA,XOD

圖1 組方對小鼠腎臟中URAT1蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of component on URAT1 protein expression in kidney of

圖2 小鼠腎臟中URAT1蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)Fig.2 Expression of URAT1 protein in kidney of mice注:與正常組比較:## P<0.01;與模型組比較,* P<0.05,** P<0.01。

2.3 組方對小鼠血清中AST、ALT、CRE及BUN水平的影響

由表2可知，與正常組比較,模型組小鼠血清AST、ALT含量的極顯著升高(P<0.01)，提示持續(xù)的高尿酸可引起肝臟損傷;同樣地,CRE、BUN含量也極顯著升高(P<0.01),說明尿酸水平的升高也造成了腎損傷。與模型組比較,組方高、低劑量組的AST、ALT、CRE及BUN含量均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表2 組方對小鼠血清中AST、ALT、CRE及BUN含量的影響Table 2 Effects of component on serum AST,ALT,CRE,BUN

2.4 組方對小鼠肝臟、腎臟病理組織學(xué)的影響

由圖3可知，正常組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常,肝小體邊界明顯且大小正常;模型組肝小體包漿破碎,邊界十分不明顯,有較大的炎癥浸潤;與模型組相比,組方高、低劑量組中肝組織皆有不同程度的改善,肝小體、肝小葉相對完整,細(xì)胞水腫面積縮小、未出現(xiàn)晶體沉淀現(xiàn)象;相比低劑量組,組方高劑量組的肝小體邊界更為明顯,炎癥浸潤更少。

圖3 組方對高尿酸血癥小鼠肝、腎臟病理組織學(xué)的影響(HE,200×)Fig.3 Histological analysis of mice liver and kidney tissues of different groups(HE staining,200×)

腎臟病理圖中,正常組小鼠腎小管無腫脹擴(kuò)張現(xiàn)象,腎小球性狀、大小均正常;模型組腎小管腫大,出現(xiàn)蛋白管,透明管形,炎癥浸潤明顯,或有些許晶體小塊嵌于組織;組方高、低劑量組病理改變均不明顯,腎臟結(jié)構(gòu)基本正常,細(xì)胞水腫面積縮小、炎癥浸潤相對較少。

2.5 組方對小鼠右踝關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)的影響

由表3可知，與正常組相比,模型組在各時(shí)間觀察踝關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)均升高,表示尿酸鈉致小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎造模成功;各組小鼠在造模后12 h踝關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)達(dá)到峰值,同人類痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作情況類似;與模型對照組比較,陽性藥物別嘌醇組、組方高、低劑量組給藥后關(guān)節(jié)炎指數(shù)均有不同程度降低,造模后24 h炎癥指數(shù)下降尤其明顯。

表3 小鼠右踝關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)觀察結(jié)果Table 3 Observation results of inflammatory index of right ankle joint in mice

2.6 組方對小鼠關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)溫度變化的影響

由表4可知，與空白組比較,模型組小鼠關(guān)節(jié)腫脹度及腫脹部位溫度極顯著增加(P<0.01),表示關(guān)節(jié)腔注射尿酸鈉可致小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎;同模型組比較,組方高劑量組小鼠的關(guān)節(jié)腫脹度顯著降低(P<0.05);組方高、低劑量組的關(guān)節(jié)紅外溫度均極顯著降低(P<0.01)。

表4 組方藥物對小鼠關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)溫度變化的影響Table 4 Effect of component on joint swelling

2.7 組方對小鼠血清中炎癥因子IL-1β及TNF-α的含量影響

由表5可知，與正常組比較,模型組中炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01),提示高尿酸可能導(dǎo)致炎癥;與模型組比較,組方高劑量組的IL-1β顯著降低(P<0.05);組方高、低劑量組的TNF-α水平極顯著降低(P<0.01)。表5的炎癥指標(biāo)結(jié)果與表3、表4表觀關(guān)節(jié)炎癥程度基本對應(yīng),提示組方組有較明顯的抗炎作用。

表5 組方對小鼠血清中IL-1β及TNF-α含量的影響Table 5 Effect of component on serum IL-1β,TNF-α

2.8 組方對小鼠關(guān)節(jié)病理組織學(xué)的影響

如圖4所示,正常組滑膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)光滑完整,未見細(xì)胞増生病變,極少量炎細(xì)胞浸潤周邊組織;模型組的關(guān)節(jié)中,滑膜上皮細(xì)胞增生約3層,大量炎癥細(xì)胞浸潤踝關(guān)節(jié)滑膜及周邊組織,有水腫等病變情況,關(guān)節(jié)炎癥浸潤密集且有關(guān)節(jié)腔內(nèi)滲出物;陽性組別嘌醇組滑膜上皮細(xì)胞與正常對照組近似,其滑膜組織并未出現(xiàn)增生,軟組織呈少許炎癥浸潤,軟骨面、關(guān)節(jié)腔無病變現(xiàn)象;組方高、低劑量組功效相當(dāng),滑膜組織出現(xiàn)單層增生,軟組織有炎癥浸潤,軟骨面未出現(xiàn)病變;關(guān)節(jié)炎癥浸潤較少,未觀察到關(guān)節(jié)腔內(nèi)滲出物。

圖4 組方對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)病理組織學(xué)的影響(HE,200×)Fig.4 Histological analysis of mice joint tissues of different groups(HE staining,200×)

3 討論與結(jié)論

本研究選用PO和尿酸鈉誘導(dǎo)小鼠高尿酸合并痛風(fēng)模型,并以別嘌呤醇為陽性對照組,對組方的療效及安全性進(jìn)行全面的評價(jià)。動(dòng)物整體狀態(tài)、尿酸水平、肝腎損傷、炎癥因子水平等多個(gè)指標(biāo)的變化,均指示該模型符合預(yù)期模型病理改變特點(diǎn),該模型構(gòu)建良好。UA是人體嘌呤核苷酸代謝的終產(chǎn)物,主要經(jīng)肝臟中廣泛分布的黃嘌呤氧化酶(XOD)催化合成,再經(jīng)腎臟排泄。XOD是該過程中的關(guān)鍵限速酶,其水平越高,表明產(chǎn)生的UA越多[15-17]。URAT1是尿酸排泄關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,主要位于腎皮質(zhì)近曲小管的上皮細(xì)胞刷狀緣,介導(dǎo)尿酸鹽從腎小管腔向血液的再吸收,對人體腎臟調(diào)節(jié)尿酸水平具有重要生理學(xué)意義,是促尿酸排泄藥物研究的重要靶點(diǎn)[18-19]。實(shí)驗(yàn)表明,與模型組比較,組方高劑量組的UA、XOD水平極顯著降低(P<0.01),URAT1蛋白水平也有顯著下降(P<0.05),提示該組方可能通過抑制XOD水平,促進(jìn)尿酸排泄,從而減低血尿酸濃度,達(dá)到治療痛風(fēng)的療效。除此之外,持續(xù)的高尿酸可引起肝、腎功能損傷,測定肝臟ALT/AST、腎臟CRE/BUN可反映小鼠的肝腎保護(hù)或損傷情況[20],本研究組方治療小鼠高尿酸合并痛風(fēng)模型15 d后,與模型組比較,組方高、低劑量組的AST、ALT、CRE及BUN含量均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01),且肝、腎組織形態(tài)良好,顯示較好的肝腎保護(hù)作用。

尿酸和尿酸鹽在關(guān)節(jié)、腎臟的沉積會(huì)導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞黏附滲出,釋放炎性因子。IL-1β是痛風(fēng)急性發(fā)作的關(guān)鍵因子,TNF-α是炎癥反應(yīng)過程出現(xiàn)的最早、最重要的炎性因子,是炎癥的啟動(dòng)子,也是持續(xù)炎癥反應(yīng)的誘發(fā)因子[21-25]。炎癥因子IL-1β及TNF-α的表達(dá)水平的升高提示體內(nèi)持續(xù)炎性反應(yīng)程度也較高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型組比較,組方高劑量組的IL-1β水平顯著降低(P<0.05);組方高、低劑量組的TNF-α水平極顯著降低(P<0.01),提示組方可能通過抑制炎癥因子的趨化和聚集,從而達(dá)到減輕炎癥反應(yīng)的作用。小鼠關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)溫度、關(guān)節(jié)病理表現(xiàn)的改善也進(jìn)一步說明了該組方具有較好的關(guān)節(jié)保護(hù)作用。

本研究從動(dòng)物水平和分子生物學(xué)水平證實(shí)了,由菊苣、葛根及桑葉為主要成分的組方對PO誘導(dǎo)的高尿酸血癥合并關(guān)節(jié)炎小鼠具有降尿酸、關(guān)節(jié)保護(hù)及肝腎保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與改善肝腎損傷,降低血清尿酸以及減少URAT1蛋白的表達(dá)相關(guān),可為進(jìn)一步開發(fā)該組方產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。