葛仙米對大鼠的潤腸通便作用研究

劉銀路,畢萃萃,魏芬芬,陳 盛,王玉蘭,張 波,*

(1.北京聯合大學,功能食品科學技術研究院,生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室,北京 100191;2.湖南炎帝生物工程有限公司,湖南株洲 412000)

便秘是一種常見的慢性胃腸疾病,糞便干硬、排便困難或者每周排便次數少于三次即視為便秘[1-3]。便秘可以分為器質性便秘(organic constipation)和功能性便秘(functional constipation,FC),器質性便秘是一種病理性便秘,可以由內分泌疾病、消化道疾病和神經系統疾病等原因導致,需要藥物維持治療,具有不可逆性;功能性便秘是無明顯器質性病變或繼發于代謝病、系統性疾病或因為藥物因素而引起的功能性排便困難為特征的便秘,主要由于腸功能紊亂引起。FC又可以分為慢傳輸性便秘(slow-transit constipation,STC)和出口梗阻性便秘(outlet obstruction constipation)以及混合型便秘(mixed constipation),其中慢傳輸性便秘相對來說是最普遍的一種癥狀。流行病學研究顯示,世界上有2%～20%的人有便秘癥狀,我國STC患病率在6%左右,其中男女比例為1∶2,并且有逐年增加的趨勢[4-7]。造成慢傳輸型便秘的原因有很多,包括膳食纖維和液體攝入量不足,不良飲食習慣以及缺乏鍛煉等因素。治療便秘藥物種類有瀉藥、滲透劑、刺激性瀉藥和潤滑劑等常見刺激性瀉藥,又包括塞納、大黃、番瀉葉和多磺酸鹽等藥物,這些藥物作用比較明顯,但長期服用會有不良副作用產生[8]。目前食品和制藥行業對具有通便作用的生物活性物質的研究越來越感興趣,與相關藥品相比,天然生物活性物質通常在疾病控制和預防方面也具有較好療效,且因低毒性和較少副作用而深受消費者喜歡[9-12]。

球狀念珠藻(Nostocsphaeroideskiitzing)俗稱葛仙米、天仙菜、珍珠菜、水木耳、田木耳,屬于藍藻門藍藻綱念珠藻目念珠藻科念珠藻屬,廣泛分布在我國湖北省鶴峰縣。葛仙米是一種傳統的藥食兩用藻類,在我國具有悠久的食用歷史。研究表明,葛仙米中含有豐富的生物活性物質,包括蛋白質、多糖、氨基酸、維生素和礦物質等,葛仙米具有多種生物活性,例如抗炎抗菌、抗癌、降血脂等功效[13-14]。葛仙米中有較高含量的膳食纖維,然而葛仙米在潤腸通便方面還鮮有研究[15-17]。本實驗采用鹽酸洛哌丁胺誘導大鼠慢傳輸型便秘,初步觀察葛仙米對大鼠便秘的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級健康SD大鼠 24只,體質量130～150 g,雄性,購于北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證號:SCXK(京)2014-0004;葛仙米超微粉 湖南炎帝生物公司提供,在-20 ℃將葛仙米研磨成超微粉,直接供本實驗使用,其中膳食纖維(47.3%)、蛋白質(30.8%)、水分(5.54%)、灰分(5.7%);鹽酸洛哌丁胺 每粒2 mg,購于西安楊森制藥有限公司,國藥準字H10910085;墨汁的配制 準確稱取阿拉伯樹膠100 g,加水800 mL,煮沸至透明溶液,稱取活性炭(粉狀)50 g加至溶液中煮沸三次,將溶液加水定容1000 mL,于冰箱中4 ℃保存。

JJ-12J脫水機 武漢俊杰電子有限公司;JB-P5包埋機 武漢俊杰電子有限公司;RM2016病理切片機 上海徠卡儀器有限公司;JB-L5凍臺 武漢俊杰電子有限公司;KD-P 組織攤片機 浙江金華市科迪儀器設備有限公司;NIKON ECLIPSE E100正置光學顯微鏡 日本尼康。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 將大鼠置于SPF級動物房中,溫度(22±2) ℃,濕度50%～60%,每日光照和黑暗各12 h,大鼠適應性喂養一周后隨機將大鼠分為三組:對照組6只,模型組6只,葛仙米組12只。大鼠均單籠飼養。實驗進行四周,第1～3周:每天上午9:00給葛仙米組大鼠給予0.8 g/kg劑量葛仙米灌胃,對照組與模型組灌胃等量雙蒸水;第4周:模型組每天早上7:00灌胃鹽酸洛哌丁胺(3 mg/kg),2 h后灌胃等量雙蒸水;葛仙米組每天早上7:00灌胃鹽酸洛哌丁胺(3 mg/kg),2 h后灌胃0.8 g/kg的葛仙米;對照組每天早上7:00灌胃等量生理鹽水。

1.2.2 動物體重及進食量 在實驗過程中,每周記錄大鼠體重及攝食量。

1.2.3 動物糞便重量及含水量測定 在實驗的第3周末和第4周末,記錄糞便量。在實驗當天早上8:00,去除大鼠籠內墊料,保證籠內干燥,以免影響糞便重量以及含水量。然后收集8 h內動物糞便并稱重,記為糞便濕重W1,然后將動物糞便置于恒溫干燥箱中80 ℃條件下烘干2 h并稱重,記為糞便干重W2。糞便含水量計算如下所示:

式中:W1表示糞便濕重,g;W2表示糞便干重,g。

1.2.4 動物產生黑便時間 實驗第4周末,早上7:00給模型組和葛仙米組大鼠給予鹽酸羅哌丁胺灌胃,對照組給予等量生理鹽水灌胃,9:00各組給予墨汁灌胃,正常飲食,每間隔30 min觀察一次,記錄首粒黑便時間。

1.2.5 大鼠遠端結腸病理觀察 采用股動脈放血處死大鼠。取大鼠遠端結腸組織用生理鹽水進行清理后放入4%組織固定液中進行固定、脫水、透明、浸蠟與包埋,制成蠟塊,石蠟切片。

HE染色:二甲苯脫蠟2×10 min,無水乙醇洗去二甲苯2×5 min;95%、80%乙醇浸泡各10 min,水洗;蘇木素染色4 min,水洗;鹽酸酒精分化20 s,水洗;稀氨水返藍30 s,水洗;伊紅染色90 s;80%乙醇脫水10 s,95%乙醇浸泡10 s,無水乙醇浸泡5 min;無水乙醇浸泡10 min;二甲苯浸泡2×10 min,中性樹膠封片并在顯微鏡下觀察。

AB-PAS染色:石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min-二甲苯Ⅱ 20 min-無水乙醇Ⅰ 5 min-無水乙醇Ⅱ 5 min-75%酒精5 min,自來水洗;阿利新藍染色:切片入阿利新藍染液中染色5 min,自來水洗2 min;高碘酸染色:切片入高碘酸染液中15 min,自來水洗,蒸餾水洗兩遍;雪弗染色:切片入雪弗染液避光染色30 min,流水沖洗5 min;蘇木素染色:切片入蘇木素染液染3～5 min,自來水洗,分化液分化,自來水洗,返藍液返藍,流水沖洗;脫水封片:切片依次入無水乙醇Ⅰ 5 min-無水乙醇Ⅱ 5 min-無水乙醇Ⅲ 5 min-二甲苯Ⅰ 5 min-二甲苯Ⅱ 5 min透明,中性樹膠封片并在顯微鏡下觀察。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 葛仙米對大鼠體重及進食量的影響

由圖1看出,各組大鼠初始體重無差別,在后續生長過程中雖然葛仙米組大鼠與模型組和對照組大鼠相比略有下降,但并無顯著性差異。表示葛仙米對大鼠生長無明顯影響。實驗結束時各組動物活動正常,毛發狀況良好。圖2中顯示,大鼠在實驗中進食量無顯著性差異,灌胃鹽酸洛哌丁胺的一周中,大鼠進食量稍有減少,但無顯著性差異。

圖1 大鼠體重變化圖Fig.1 Changes of rats body

圖2 大鼠進食量Fig.2 Food intake of rats

2.2 葛仙米對大鼠糞便重量及含水量的影響

通過圖3可以看出,在造模前,各組大鼠糞便粒大小無明顯差異,造模后模型組大鼠糞便粒明顯變小,質地相對較硬,而葛仙米組大鼠糞便粒與變化不明顯。由表1所示,在灌胃鹽酸洛哌丁胺之前,葛仙米組大鼠糞便濕重以及含水量極顯著增加(P<0.01)。灌胃鹽酸洛哌丁胺后,與對照組比較,模型組大鼠糞便重量以及含水量均極顯著下降(P<0.01),但葛仙米組大鼠糞便重量及含水量極顯著高于模型組(P<0.01),表明實驗造模成功,并且葛仙米可以增加大鼠糞便含水量。

表1 灌胃鹽酸洛哌丁胺前后大鼠糞便重量及含水量Table 1 Fecal weight and water content of rats before and after intragastric administration of loperamide hydrochloride

圖3 大鼠糞便Fig.3 Stool weight of rats注:A:對照組;B:模型組;C:葛仙米組。

2.3 葛仙米對大鼠首粒黑便產生時間的影響

由圖4可知,與對照組相比,模型組產生首粒黑便時間極顯著延長(P<0.01),這可以得出大鼠便秘模型造模成功,證實了實驗可行性。另外葛仙米組與模型組大鼠相比,產生首粒黑便時間極顯著縮短(P<0.01)。這可能是葛仙米促進了腸道動力,從而縮短排便時間。

圖4 大鼠產生首粒黑便時間Fig.4 Producing the first black stool time of rats

2.4 葛仙米對大鼠結腸組織病理的影響

如圖5 HE染色觀察,對照組大鼠結腸組織結構比較完整,黏膜層中細胞排列有序。與對照組相比,模型組大鼠結腸組織結構不完整,黏液層細胞大量死亡。葛仙米組與模型組相比,結構較完整,死亡細胞減少。如圖6 AB-PAS染色觀察,對照組大鼠結腸組織黏膜層和肌層厚度正常。與對照組相比,模型組粘膜層中分泌的粘蛋白減少,尤其是酸性粘蛋白變化更顯著。如圖7統計結果,模型組大鼠結腸組織外肌層、內肌層、粘膜層厚度、杯狀細胞數以及粘膜層中粘液物質與對照組大鼠結腸組織均有極顯著性差異(P<0.01),而葛仙米組與模型組比較,大鼠結腸組織外肌層、內肌層、粘膜層、杯狀細胞數及粘液物質均有顯著增加(P<0.05)。

圖5 大鼠腸道HE染色Fig.5 HE staining of rat intestine注：指杯狀細胞；指隱窩深度。

圖6 腸道AB-PAS染色Fig.6 Intestinal AB-PAS staining注：指黏液層厚度；指肌層厚度；指黏膜損傷；指粘液物質。

圖7 大鼠腸道組織學參數Fig.7 Rat intestinal histological parameters注：A： 外肌層厚度(100×)； B： 內肌層厚度(100×)；C： 粘膜層層厚度(400× )；D： 隱窩深度(400× )； E： 杯狀細胞數(400×)；F： 粘液物質面積(400×)。

3 討論

現如今功能性便秘患病率正在逐漸升高,越來越多的人受其困擾,尤其是中老年人群,但是長期服用藥物治療便秘給身體帶來的危害極大,以番瀉葉、大黃等蒽醌類瀉藥為例,長期服用此類藥物會導致結腸黑病變,進而可能導致結直腸腫瘤,所以替代藥物找到一種既有療效而又不會給人體帶來副作用的功能性物質就顯得尤為重要[18-22]。

本實驗中,通過灌胃鹽酸洛哌丁胺建立大鼠便秘模型,檢測葛仙米對大鼠體質量、糞便重量及含水量,墨汁灌胃大鼠使產生黑便時間,以及通過HE及AB-PAS染色大鼠結腸等指標的影響,探索葛仙米的潤腸通便作用。結果表明葛仙米能夠維持大鼠糞便重量及水分含量,降低大鼠產生黑便時間,并且在腸道方面也具有顯著的變化。推測葛仙米有潤腸通便效果作用機制可能是:葛仙米可能通過調節水通道蛋白(aquaporin,AQP)增加腸道粘液,使腸道潤滑。AQPs是跨膜通道蛋白(major intrinsic protein.MIP)的一種,能夠對水分子進行跨膜運輸,維持細胞內外水液的平衡及液體的吸收與分泌,其含量和便秘、炎癥性腸病有相關性顯著,其中AQP3、4、8等存在結腸,與結腸水吸收和分泌關系密切。膳食纖維可以增加腸道蠕動,增加腸道內的水分吸收,從而增加糞便含水量。葛仙米營養豐富,富含蛋白質、氨基酸、膳食纖維、多糖、VC、VE以及B族維生素等,尤其是膳食纖維含量可高達50%左右,并且對葛仙米胞外多糖進行分析,主要包括甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。其中甘露糖具有吸水性強、粘度大和膨脹率高的特點進入腸胃后可吸收胃腸中的水分。這表示葛仙米具有潛在的改善便秘癥狀的功效[14,23-25]。葛仙米可能通過調節Cajal間質細胞調節結腸動力,減少葛仙米組大鼠產生黑便時間。Cajal間質細胞(interstitial cells of cajal,Cajal 細胞)Cajal 間質細胞是胃腸起博細胞,是ENS控制胃腸平滑肌運動的中介,參與胃腸道神經遞質的信號傳導,通過T-型和L-型Ca離子通道產生自發性節律性電活動,并且與平滑肌細胞之間存在廣泛縫隙連接,為起搏信號傳入平滑肌細胞提供通道。慢波通過電-機械耦連機制引起平滑肌收縮,對平滑肌收縮的節律、收縮波的傳導方向及傳導速度起調控作用。結腸組織內ICC數量減少及結構破壞,可使結腸起搏功能減弱及電興奮傳導衰減,導致平滑肌產生異常的不規則慢波、收縮運動障礙或不能產生有效的推進性收縮運動,出現結腸動力障礙癥狀。結腸組織病理切片觀察,葛仙米組大鼠結腸道細胞排列結構、粘液物質分泌均優于模型組。模型組中腸粘膜屏障受到破壞以及粘蛋白數量減少,而葛仙米可能是通過保護腸粘膜屏障完整性以及增加粘液物質含量,從而起到保護作用,腸上皮細胞包括腸上皮細胞、杯狀細胞、潘氏細胞和腸內分泌細胞,杯狀細胞主要分泌粘蛋白,可以依據末梢是否帶有酸基將粘蛋白分為酸性粘蛋白和中性粘蛋白,酸性粘蛋白能夠防止腸道消化酶和細菌糖苷酶對上皮細胞的消化[26-28]。總之,功能性便秘尚未有明確的作用機制,葛仙米明顯增加大鼠大腸水分含量,從而軟化大便,有利于大便的排出,并且可以加強腸蠕動,增加黏液分泌等,在本實驗中結果能夠改善便秘癥狀。但是其具體的作用機理還尚不清楚,有待進一步研究。