花旗參茶對乙醇誘導小鼠氧化損傷的保護作用

陳斯琪,李雅琦,余孝云,尚 強,3,伍 彪,聶 克,*

(1.廣東藥科大學中藥學院,廣東廣州 510006;2.健康藥業(中國)有限公司,廣東珠海 519090;3.國家中藥現代化工程技術研究中心,廣東珠海 519090)

西洋參為五加科植物西洋參(PanaxquinquefoliumL.)的干燥根,又名花旗參,具有補氣養陰、清熱生津等功效[1]。現代研究表明,西洋參具有抗氧化[2]、調節免疫[3]、抗腫瘤[4]、保護心血管系統[5]、抗衰老[6]、抗炎[7]、改善糖脂代謝[8]和改善腸道菌群[9]等生物活性,可通過恢復體內平衡預防和治療多種疾病[10]。民間有用西洋參飲片泡水服用、煲湯等習慣。花旗參茶是用西洋參經現代工藝制成的顆粒劑,用開水沖調即可飲用,具有便于攜帶、便于服用等優點。但是目前對花旗參茶的營養和保健作用的機制研究較少。

大量攝入乙醇可產生過量氧自由基,引起組織細胞過氧化以及肝臟脂肪變性、肝細胞壞死等病變[11]。機體氧化損傷是導致酒精性肝病的重要原因之一,其機制主要與機體氧化還原失衡、脂質過氧化等有關[12-13]。已有研究報道,乙醇能導致動物氧化應激,損傷肝臟,使體內的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、蛋白質羰基(Protein carbonyl,PC)水平顯著升高,總超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase,T-SOD)、微量還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)水平顯著降低,丙氨酸轉氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉氨酶(Aminotransferase,AST)、甘油三酯(Triglyceride,TG)水平顯著升高[14-16]。

本文根據原國家食品藥品監督管理局保健食品《抗氧化功能評價方法(征求意見稿)》[17],采用乙醇氧化損傷小鼠模型,觀察了花旗參茶的抗氧化損傷作用以及對乙醇所致肝損傷的保護作用,并與西洋參飲片泡水服用的抗氧化效果進行了對比。本研究首次從抗氧化和保護肝臟等方面對花旗參茶的保健作用機制進行實驗研究,為其保健應用提供了一定科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花旗參茶 3 g/袋,健康藥業(中國)有限公司;MDA試劑盒、PC試劑盒、T-SOD試劑盒、GSH試劑盒、總蛋白(Total protein,TP)試劑盒、ALT試劑盒、AST試劑盒、TG試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑 均為分析純;SPF級健康成年昆明小鼠 60只,雌性,體質量17.01±0.16 g,由南方醫科大學實驗動物中心提供,實驗動物質量許可證號SCXK(粵)2016-0041,飼養于溫度為20～25 ℃,濕度為40%～70%,12 h光照,12 h黑暗的環境,自由攝食和飲水,適應性飼養一周。

UV-2310 Ⅱ型紫外-可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司;BioTek Eon型超微量核酸蛋白分析儀 廣州云星科學儀器有限公司;TGL-16M型臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;NIKON Eclipse ci光學顯微鏡 日本尼康株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 西洋參飲片泡水樣品制備 取西洋參飲片200 g,加16倍沸水,浸泡5 min,重復3次,合并濾液,濾過,濃縮,冷凍干燥,得凍干粉40 g。

1.2.2 動物分組與給藥 選取25～30 g小鼠,隨機分為6組:空白對照組、模型對照組、花旗參茶(參茶組)低中高3個劑量組、西洋參飲片泡水(飲片泡水)對照組,每組10只。參茶3個劑量組分別灌胃給予參茶1.5、3.0、6.0 g/kg(參茶成人每日推薦用量為9 g,成人體重按60 kg計,則人用量為0.15 g/kg體重。根據藥效學研究中人與小鼠給藥劑量的換算方法[18],小鼠劑量分別相當于人用量的10倍、20倍、40倍,每3 g參茶顆粒相當于原生藥0.55 g,則分別相當于0.275、0.550、1.100 g生藥/kg體重),飲片泡水組給予泡水凍干粉0.1 g/kg(西洋參飲片成人每日用量為3 g,成人體重按60 kg計,則人用量為0.5 g/kg體重。小鼠給藥劑量相當于人用量的10倍,1 g凍干粉相當于原生藥5 g,則相當于0.500 g生藥/kg體重),模型對照組和空白對照組給予蒸餾水,各組動物灌胃容積均為20 mL/kg,連續30 d,根據每周體重調整給藥劑量。

1.2.3 指標檢測 每周稱量并記錄小鼠體重,共4周。末次灌胃后,模型對照組和各給藥組禁食16 h(過夜),稱量小鼠體重,一次性灌胃給予50%乙醇12 mL/kg bw造模,6 h后摘眼球取血(空白對照組不作處理,不禁食取血),4 ℃、2000 r/min離心10 min,制備血清,-80 ℃冰箱保存待測。取血后脫頸椎處死小鼠,解剖,迅速取出肝臟,一部分肝組織放入4%多聚甲醛固定,常規石蠟切片、HE染色;另一部分肝組織用生理鹽水或試劑盒勻漿介質低溫勻漿,4 ℃ 2000 r/min離心10 min,取上清液,待測。取出脾臟和胸腺,稱重,按以下公式計算脾臟系數和胸腺系數:脾臟系數(mg/g)=脾臟重量(mg)/體重(g),胸腺系數(mg/g)=胸腺重量(mg)/體重(g)。

按照試劑盒說明書,分別檢測血清和肝勻漿MDA、PC、T-SOD和GSH水平;檢測血清ALT、AST和TG水平。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 花旗參茶對小鼠體重的影響

由表1可知,實驗期間各組小鼠體重隨時間延長而增長,在不同時間點各組小組體重分別兩兩比較,均無統計學差異(P>0.05)。說明花旗參茶和西洋參飲片泡水對正常小鼠體重增長無明顯影響。

表1 各組小鼠體重變化(g)Table 1 Body weight of mice in each group(g)

2.2 花旗參茶對小鼠臟器系數的影響

由表2可知,各組小鼠胸腺系數和脾臟系數分別兩兩比較,均無統計學差異(P>0.05)。說明花旗參茶和西洋參飲片泡水在實驗劑量范圍對小鼠的胸腺系數和脾臟系數無明顯影響。

表2 各組小鼠臟器系數變化(mg/g)Table 2 Organ coefficient of mice in each group(mg/g)

2.3 花旗參茶對小鼠體內氧化損傷相關指標MDA、PC、T-SOD和GSH含量的影響

MDA是一種脂質氧化產物,其含量高低可反映機體內脂質過氧化的程度,間接地反映出細胞損傷的程度[19],PC可與生物大分子相互作用,引起羰基應激和氧化應激[20];T-SOD作為抗氧化系統的第一道防線,可清除超氧陰離子自由基,保護細胞免受損傷,對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用[21];氧化損傷的細胞中還原型和氧化型谷胱甘肽比例失衡,GSH作為一種低分子清除劑,可清除O2-、H2O2等,GSH含量是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素[22]。

由表3可知,與空白對照組比較,模型組小鼠血清和肝組織中MDA和PC水平極顯著升高(P<0.01),T-SOD和GSH水平顯著降低(P<0.01),說明50%乙醇氧化損傷模型成功。與模型組比較,參茶低、中、高3個劑量組血清中MDA和PC水平均極顯著降低(P<0.01),GSH水平極顯著升高(低、中、高3個劑量,均P<0.01),T-SOD水平顯著升高(低、中劑量,P<0.05;高劑量,P<0.01);飲片泡水組血清中MDA和PC水平極顯著降低(P<0.01),GSH水平顯著升高(P<0.05),T-SOD水平有升高趨勢但無統計學差異(P>0.05)。與空白對照組比較,參茶低、中、高3個劑量組血清中的MDA和PC水平升高,T-SOD水平降低,低、中劑量組的GSH水平降低,高劑量組的GSH水平升高,但均無統計學差異(P>0.05);飲片泡水組血清中MDA水平顯著高于空白對照組(P<0.05),T-SOD水平顯著低于空白對照組(P<0.05),而PC水平有升高趨勢,GSH水平有降低趨勢,但均無統計學差異(P>0.05)。

表3 花旗參茶對各組小鼠血清中MDA、PC、T-SOD和GSH含量的影響Table 3 Effect of ginseng tea on MDA,PC,T-SOD and GSH in serum of mice in each group

以上結果說明,花旗參茶可劑量依賴性地降低乙醇氧化損傷小鼠血清中脂質過氧化和蛋白質氧化水平,提高抗氧化酶活性和抗氧化物質水平,發揮顯著的抗氧化作用。西洋參飲片泡水組的給藥劑量(0.500 g生藥/kg)與花旗參茶中劑量(0.550 g生藥/kg)相近,但其對抗氧化相關指標的改善程度只與花旗參茶低劑量(0.275 g生藥/kg)相當,說明在同等劑量下,花旗參茶對氧化損傷的改善效果優于西洋參飲片泡水。

由表4可知,與模型組比較,參茶低、中、高3個劑量組和飲片泡水組肝組織中MDA和PC水平極顯著降低(P<0.01),T-SOD和GSH水平極顯著升高(P<0.01)。與空白對照組比較,參茶低劑量組肝組織中MDA和PC水平有升高趨勢,中、高劑量組MDA和PC水平有降低趨勢,但均無統計學差異(P>0.05);參茶低劑量組T-SOD極顯著降低(P<0.01),而中、高劑量組T-SOD水平有降低趨勢但均無統計學差異(P>0.05);參茶低劑量組GSH水平有升高趨勢但無統計學差異(P>0.05),而中、高劑量GSH水平顯著升高(分別P<0.05,P<0.01);飲片泡水組肝組織中的MDA、PC和GSH水平有升高趨勢,T-SOD水平有降低趨勢,但均無統計學差異(P>0.05)。

表4 花旗參茶對各組小鼠肝組織中MDA、PC、T-SOD和GSH水平的影響Table 4 Effect of ginseng tea on MDA,PC,T-SOD and GSH levels in liver tissues of mice in each group

肝組織中抗氧化相關指標測定結果與上述血清中抗氧化指標測定結果一致,進一步說明花旗參茶具有顯著的抗氧化作用,并且在同等劑量下,花旗參茶對乙醇誘導氧化損傷的改善效果優于西洋參飲片泡水。

2.4 花旗參茶對小鼠體內肝損傷相關指標ALT、AST和TG水平的影響

ALT和AST是臨床上廣泛應用于肝功能檢測的生化指標,當肝細胞受損變性時,肝細胞的胞漿釋放ALT到血液中,當肝細胞嚴重受損、壞死時,肝細胞的線粒體釋放AST到血液中,使血清ALT或AST含量增加,在肝功能檢查中,ALT、AST分別是反映肝細胞受損、肝細胞壞死的指標[23];肝臟是合成、貯存TG的場所,TG含量偏高指示脂質的沉積[24]。

由表5可知,與空白對照組比較,模型組小鼠血清ALT、AST和TG水平極顯著升高(P<0.01),說明50%乙醇可造成肝臟急性損傷和脂質沉積。與模型對照組比較,參茶3個劑量組和飲片泡水組血清中ALT水平極顯著降低(P<0.01),AST水平顯著降低(參茶3個劑量組P<0.01,飲片泡水組P<0.05);參茶中、高劑量組血清TG水平極顯著降低(P<0.01),而參茶低劑量組和飲片泡水組TG水平只有降低趨勢。與空白對照組比較,參茶中、高劑量組的ALT水平略有升高,但無統計學差異(P>0.05),但參茶低劑量組和飲片泡水組血清ALT水平顯著高于空白組(分別P<0.05,P<0.01);參茶3個劑量組和飲片泡水組血清AST水平均極顯著高于空白組(P<0.01);參茶3個劑量組和飲片泡水組血清TG水平均略高于空白組,但均無統計學差異(均P>0.05),見表5。以上結果說明,花旗參茶可減少乙醇誘導肝損傷小鼠的肝細胞中轉氨酶和TG的釋放,可能是通過調節肝細胞的細胞膜通透性,減少脂質堆積,保護肝臟。在同等劑量下,花旗參茶對乙醇誘導肝損傷的改善效果優于西洋參泡水。

表5 花旗參茶對各組小鼠血清中ALT、AST和TG水平的影響Table 5 Effect of ginseng tea on ALT,AST and TG levels in serum of mice in each group

2.5 花旗參茶對小鼠肝損傷的病理分析

酒精導致的肝臟損傷除了轉氨酶和TG的水平改變,也會造成肝細胞凋亡和產生炎癥[25]。HE染色結果顯示(圖1),空白對照組小鼠肝臟結構清晰,細胞正常;50%乙醇造模后,模型組小鼠肝組織出現明顯的細胞空泡變性、壞死、胞質疏松淡染、細小泡沫樣,且少數肝細胞嗜酸性增強,胞質內有伊紅染半透明小體,指示存在炎癥。與模型組比較,參茶低劑量組肝損傷程度與模型組無明顯差異,中、高劑量組小鼠肝損傷程度較模型組輕,高劑量改善效果最明顯;西洋參飲片泡水組損傷程度嚴重,未見明顯改善。與空白對照組比較,參茶低、中、高劑量組小鼠肝組織出現細胞變性壞死、炎性浸潤等不同程度損傷,高劑量改善效果最好;西洋參飲片泡水組小鼠肝組織出現細胞變性壞死和炎性浸潤,損傷程度嚴重。說明中、高劑量的花旗參茶可減輕乙醇誘導肝損傷小鼠的肝臟炎癥和維持肝細胞正常結構,高劑量組的改善效果最明顯。

圖1 各組小鼠肝組織HE染色病理分析圖(200×)Fig.1 Pathological analysis of HE staining of liver tissues of mice in each group(200×)注:1為細胞變性;2為細胞壞死;3為強嗜酸性細胞;4為嗜酸性小體。

3 結論與討論

乙醇在體內經過一系列生物代謝過程,產生乙醛等有害物質,導致氧化應激,對肝臟等器官造成損傷[26]。本實驗通過建立乙醇氧化損傷小鼠模型,檢測血清和肝組織中MDA、PC、T-SOD和GSH的含量,評估花旗參茶的抗氧化作用;通過檢測血清中ALT、AST和TG含量,并結合病理觀察,評估花旗參茶對肝損傷的改善作用。結果表明,花旗參茶和西洋參飲片泡水可通過抑制機體脂質過氧化和蛋白質氧化、提高抗氧化酶活性和抗氧化物水平,并減輕肝組織空泡變性和炎癥反應等病理改變,進而減輕乙醇對機體的氧化損傷和急性肝損傷。另有研究表明,西洋參對電離輻射導致的小鼠氧化損傷具有保護作用[27],對對乙酰氨基酚和環磷酰胺導致的小鼠肝損傷具有保護作用[28-29],說明西洋參具有確切的抗氧化和肝保護作用,與本文用乙醇誘導小鼠氧化損傷和肝損傷模型的實驗結果一致。

花旗參茶通過降低乙醇氧化損傷小鼠體內MDA、PC水平,升高SOD、GSH水平,維持氧化與抗氧化平衡,減少肝組織中的ALT、AST和TG釋放到血液,并減輕肝組織中肝細胞壞死、變性、炎性浸潤等病理改變,從而發揮顯著的抗氧化和保護乙醇急性肝損傷作用。在同等劑量下,花旗參茶的抗氧化作用和保護肝損傷作用優于西洋參飲片。本研究只對花旗參茶抗氧化和保肝的作用機制進行了探討,而其調節免疫、抗疲勞等作用及作用機制尚待下一步繼續研究。后續可通過網絡藥理學、分子對接等技術,深入挖掘花旗參茶抗氧化、保肝等作用的有效成分、作用靶點和信號通路,并通過相關實驗進行驗證,以更深入、更全面闡明花旗參茶的保健作用機制。