環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合免疫層析試紙條快速檢測(cè)羊肉及其制品中的鴨源成分

柳海賓,張海鑫,宋騰飛,劉 聰,聶付磊

(華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北唐山 063200)

近年來(lái),肉類及其制品的摻假現(xiàn)象屢見不鮮。肉類制品的摻假通常包括以價(jià)格或營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較低廉的肉代替價(jià)格較高的肉,以期降低商品的成本來(lái)獲得較高經(jīng)濟(jì)利益[1-2]。這種行為損害消費(fèi)者經(jīng)濟(jì)利益、導(dǎo)致因過敏反應(yīng)[3]帶來(lái)的健康風(fēng)險(xiǎn),甚至影響肉類食品產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。2014年在北京的一項(xiàng)調(diào)查顯示,羊肉及其制品中的摻假率高達(dá)40.8%,摻假物主要以鴨肉為主,還包括豬肉和雞肉等價(jià)格相對(duì)較低廉的肉類[4-5]。因此,為了保護(hù)消費(fèi)者和生產(chǎn)者免受欺詐,確保食品安全和公眾健康,急需開發(fā)靈敏、快速、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉的分析方法來(lái)確定肉類及其制品摻假的動(dòng)物來(lái)源。

目前,對(duì)于肉類真?zhèn)舞b別的檢測(cè)方法主要是在蛋白質(zhì)和核酸的水平進(jìn)行,常用的檢測(cè)技術(shù)包括ELISA法[6]、質(zhì)譜分析[7]、紅外光譜分析[8-9]、PCR為基礎(chǔ)的方法[10-11]和恒溫核酸擴(kuò)增等基礎(chǔ)的方法[12-13]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種恒溫核酸擴(kuò)增方法,即可以在恒定溫度(60～65 ℃)下將幾個(gè)拷貝的核酸分子擴(kuò)增109～1010倍[14]。由于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可以在恒定溫度下完成擴(kuò)增反應(yīng),因此僅需要一臺(tái)數(shù)字化水浴鍋即可完成擴(kuò)增過程,對(duì)儀器的依賴程度低。傳統(tǒng)的檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的方法主要是瓊脂糖凝膠電泳分析法[15]和熒光染料法[16]。電泳分析法需要電泳儀、專業(yè)的操作人員而且耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)(30 min)。熒光染料法是利用染料與雙鏈DNA結(jié)合并產(chǎn)生熒光實(shí)現(xiàn)對(duì)LAMP產(chǎn)物的檢測(cè),該法雖然簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟,但熒光染料的加入可能會(huì)對(duì)LAMP反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用[17]。免疫層析試紙條法可以在無(wú)需儀器的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)LAMP產(chǎn)物的可視化快速檢測(cè),完成整個(gè)檢測(cè)過程只需5 min,通過肉眼即可觀察檢測(cè)結(jié)果[18],是一種快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)方法。

本研究將LAMP技術(shù)與免疫層析試紙條相結(jié)合,根據(jù)鴨線粒體基因設(shè)計(jì)LAMP引物,通過試驗(yàn)條件的優(yōu)化,建立了一種可在羊肉及其制品中特異性檢測(cè)鴨源成分的快速檢測(cè)方法。本方法的建立為羊肉及其制品的摻假鑒別提供方法依據(jù),為監(jiān)管部門提供可靠的執(zhí)法依據(jù),具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉、兔肉、驢肉、馬肉、鵝肉、狗肉、鴿子肉,羊肉片、醬羊肉、羊肉串、鴨肉、熟鴨肉等商業(yè)化產(chǎn)品20份 唐山市各屠宰場(chǎng)及大型超市;WarmStart?LAMP試劑盒 New England biolabs公司;硝酸纖維素膜、PVC背板、吸水紙、玻璃纖維 上海金標(biāo)生物科技有限公司;氯金酸、檸檬酸三鈉、鏈霉親和素 Sigma公司;天根基因組DNA提取試劑盒 天根生物科技有限公司;鼠抗地高辛單克隆抗體 Abcam公司。

Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司;SY-1-2電熱恒溫水浴鍋 天津歐諾儀器儀表有限公司;HM3035雙維往復(fù)劃膜儀、ZQ2000微電腦自動(dòng)斬切機(jī) 上海金標(biāo)生物科技有限司;6132紫外可見分光光度計(jì) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的收集和處理 新鮮的羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉、兔肉、驢肉、馬肉、鵝肉、狗肉、鴿子肉購(gòu)自唐山市各大型超市及屠宰場(chǎng);同時(shí)采集羊肉片、醬羊肉、羊肉串、鴨肉、熟鴨肉等商業(yè)化產(chǎn)品20份,將所有采集回來(lái)的樣品使用蒸餾水沖洗干凈切碎于-20 ℃保存?zhèn)溆谩榱四M不同程度的摻假肉樣品,將切碎的羊肉和鴨肉按不同質(zhì)量比例混合均勻制備標(biāo)準(zhǔn)樣品,鴨肉與羊肉混合的比例分別為100%、0%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0%,將模擬的標(biāo)準(zhǔn)肉樣品充分混合均勻后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA的提取 采用天根基因組DNA提取試劑盒提取肉樣品基因組DNA,使用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定提取的DNA樣品的OD260/OD280值,測(cè)定值需在1.7～1.9之間才能保證提取的DNA有較高的純度[19]。

1.2.3 LAMP引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中鴨線粒體基因序列(EU009397.1),采用在線LAMP引物設(shè)計(jì)軟件primer explorer V4設(shè)計(jì)鴨特異性LAMP引物,引物序列如表1所示,F3、B3為兩條外引物,FIP、BIP為內(nèi)引物,LF、LB為環(huán)引物,引物設(shè)計(jì)好后由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 LAMP引物序列Table 1 Primer sequences of LAMP

1.2.4 膠體金免疫層析試紙條的制備 根據(jù)Grabar等[20]報(bào)道的方法,合成粒徑(15±3) nm的膠體金。地高辛抗體偶聯(lián)膠體金納米粒子的制備及試紙條的組裝依據(jù)之前優(yōu)化的結(jié)果[21]。試紙條的組成部分包括吸水紙、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊、PVC背板;各部分按圖1所示的順序進(jìn)行組裝,即硝酸纖維素膜貼在PVC背板的中間,兩側(cè)分別粘貼樣品墊和吸水紙,在硝酸纖維素膜和樣品墊之間粘貼金標(biāo)墊。最后使用微電腦自動(dòng)斬切機(jī)將組裝好的試紙條切割成3.7 mm寬的條,室溫干燥下避光保存、備用。試紙條的工作原理主要是免疫夾心反應(yīng)(圖1)。LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后會(huì)產(chǎn)生大量生物素和地高辛標(biāo)記的雙鏈DNA產(chǎn)物,將LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后滴加于試紙條的樣品墊上,混合液首先與金標(biāo)墊上的鼠抗地高辛抗體包裹的膠體金納米粒子特異性結(jié)合,形成生物素-DNA-地高辛-鼠抗地高辛抗體-金納米粒子復(fù)合物,該復(fù)合物在毛細(xì)管的作用下向吸水紙方向移動(dòng),與檢測(cè)線上的鏈霉親和素發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),膠體金納米粒子在檢測(cè)線上的富集形成肉眼可見的紅色條帶,過量的鼠抗地高辛抗體偶聯(lián)的金納米粒子繼續(xù)向吸水紙方向移動(dòng),與質(zhì)控線上的羊抗鼠二抗發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),使質(zhì)控線上形成肉眼可見的紅色條帶。因此,在目標(biāo)物存在的情況下,即有生物素和地高辛標(biāo)記的雙鏈DNA產(chǎn)物時(shí),試紙條上形成兩條肉眼可見的紅色條帶;在目標(biāo)物不存在的情況下,不會(huì)產(chǎn)生生物素和地高辛標(biāo)記的雙鏈DNA產(chǎn)物,試紙條檢測(cè)線不會(huì)顯色,僅質(zhì)控線顯色。質(zhì)控線存在的目的是為了驗(yàn)證試紙條是否能正常工作。

圖1 LAMP-ICTS檢測(cè)原理Fig.1 Schematic diagram of LAMP-ICTS

1.2.5 LAMP擴(kuò)增反應(yīng) 根據(jù)LAMP試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。首先需要配制10×引物儲(chǔ)備液,儲(chǔ)備液中各引物的濃度分別為:FIP:16 μmol/L,BIP:16 μmol/L,F3:2 μmol/L,B3:2 μmol/L,LF:4 μmol/L,LB:4 μmol/L。LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為:2×master mix:12.5 μL,引物mix:2.5 μL,DNA模板:1 μL,蒸餾水:9 μL。配制好LAMP反應(yīng)體系后上下顛倒混勻并簡(jiǎn)短離心以除去管內(nèi)壁上的液珠,分別在61、63、65、67、69 ℃的溫度下反應(yīng)30 min來(lái)優(yōu)化LAMP反應(yīng)溫度,隨后80 ℃下處理5 min來(lái)結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物使用試紙條進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 對(duì)試紙條的工作條件進(jìn)行優(yōu)化 在實(shí)際應(yīng)用試紙條進(jìn)行檢測(cè)的過程中發(fā)現(xiàn),NC膜的流速和上樣緩沖液的種類對(duì)試紙條檢測(cè)的靈敏度影響較大,因此對(duì)不同流速的NC膜(180、135、90 s/4 cm)和不同種類的上樣緩沖液(pH=7.4的0.01 mol/L的PB緩沖液,pH分別為5.6,7.4,8.5的0.01 mol/L的PBS緩沖液)進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試方法為:對(duì)NC膜進(jìn)行優(yōu)化時(shí),取10 μL的LAMP產(chǎn)物與90 μL的0.01 mol/L的PBS pH=7.4混合均勻后,滴加于不同種類NC膜組成的試紙條的樣品墊上,5 min后觀察檢測(cè)結(jié)果;對(duì)上樣緩沖液進(jìn)行優(yōu)化時(shí),取10 μL的LAMP產(chǎn)物與90 μL的不同種類的上樣緩沖液,混合均勻后,滴加于試紙條的樣品墊上,此時(shí)NC膜使用HF135s,5 min后觀察檢測(cè)試紙條顯色情況。

1.2.7 LAMP-ICTS靈敏度及特異性分析 將步驟1.2.1制備的不同鴨肉摻入比例的肉樣品提取基因組DNA后,使用LAMP擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增,并同時(shí)使用瓊脂糖凝膠電泳[22]和試紙條進(jìn)行檢測(cè),對(duì)試紙條和瓊脂糖凝膠電泳的靈敏度進(jìn)行比較分析。陰性對(duì)照組采用同等體積的蒸餾水代替基因組DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng),反應(yīng)后同樣使用試紙條進(jìn)行檢測(cè)。分別以魚肉、雞肉等10種肉樣品的基因組DNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,使用試紙條進(jìn)行檢測(cè),檢驗(yàn)LAMP-ICTS方法的特異性。

1.2.8 LAMP-ICTS檢測(cè)實(shí)際樣品 從唐山市各大型超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、飯店和淘寶網(wǎng)購(gòu)買經(jīng)加工和未經(jīng)加工的肉制品20份,分別提取其基因組DNA后,進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng),并使用試紙條進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)使用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中鴨成分檢測(cè)PCR法[23]對(duì)LAMP-ICTS的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,以確定LAMP-ICTS方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP擴(kuò)增反應(yīng)溫度的優(yōu)化

將配制好的LAMP體系分別放置在61、63、65、67、69 ℃的溫度下反應(yīng)30 min,使用試紙條對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖2所示。擴(kuò)增反應(yīng)溫度為65 ℃時(shí),試紙條的紅色條帶最明顯,因此LAMP擴(kuò)增反應(yīng)最優(yōu)的溫度為65 ℃。

圖2 LAMP擴(kuò)增反應(yīng)溫度優(yōu)化Fig.2 Optimization the amplification temperature of LAMP注:C:質(zhì)控線;T:檢測(cè)線;圖3～圖5同。

2.2 試紙條工作條件的優(yōu)化

對(duì)試紙條NC膜的流速和上樣緩沖液的種類優(yōu)化的結(jié)果如圖3所示,上樣緩沖液對(duì)鏈霉親和素和生物素結(jié)合影響較大,即主要影響檢測(cè)線的顯色情況。當(dāng)上樣緩沖液為PBS(pH=7.4),NC膜型號(hào)為HF135 s時(shí),試紙條顯色較好。

圖3 優(yōu)化上樣緩沖液(A)和NC膜孔徑(B)Fig.3 Optimization of running buffer(A) and the flow rate of NC membrane(B)注:RB1:PBS(pH=7.4);RB2:PB(pH=7.4);RB3:PBS(pH=5.6);RB4:PBS(pH=8.5)。

2.3 LAMP-ICTS檢測(cè)鴨源成分的靈敏度

在最優(yōu)的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)溫度及最優(yōu)的試紙條工作條件下,LAMP-ICTS的檢測(cè)靈敏度如圖4A所示,LAMP-ICTS可檢測(cè)到0.01%的鴨源性成分,隨著鴨源性成分含量的增加,試紙條檢測(cè)線顏色的深度呈增加的趨勢(shì)。使用瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel eletrophoresis,AGE)對(duì)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如圖4B所示,LAMP-AGE可檢測(cè)0.1%的鴨源性成分。LAMP-ICTS與LAMP-AGE相比,檢測(cè)的靈敏度提高了10倍。Zhao等[11]建立的PCR-ICTS方法檢測(cè)火雞成分,最低檢測(cè)限為0.1%,檢測(cè)靈敏度較低且需要PCR儀。李向麗等[24]建立LAMP-SYBRGreen I方法檢測(cè)羊肉中的豬源、鴨源和羊源性成分,檢測(cè)限為0.5%。

圖4 LAMP-ICTS(A)和LAMP-AGE(B)檢測(cè)鴨源性成分的靈敏度Fig.4 Sensitivity of LAMP-ICTS(A)and LAMP-AGE(B) in detection of duck derived components注:NC:陰性對(duì)照;M:DNA marker。

Karabasanavar等[25]建立的PCR-電泳方法檢測(cè)豬源性成分,其檢測(cè)限為0.1%。Vaagt等[26]建立的LAMP-電泳方法檢測(cè)毒蘑菇,其檢測(cè)限為0.2%。因此,與文獻(xiàn)[11,24-26]中建立的方法相比,本研究建立的LAMP-ICTS方法靈敏度高、對(duì)儀器的依賴程度低,更適用于基層單位和政府部門對(duì)肉類產(chǎn)品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

2.4 LAMP-ICTS特異性分析

LAMP-ICTS特異性驗(yàn)證結(jié)果如圖5所示,只有在LAMP擴(kuò)增反應(yīng)過程中加入鴨肉中提取的模板DNA后,試紙條有兩條紅色條帶,其他的動(dòng)物源性DNA只能使試紙條質(zhì)控線顯色,因此本研究建立的LAMP-ICTS對(duì)肉樣品中鴨源性成分有很好的特異性。

圖5 LAMP-ICTS的特異性Fig.5 Specificity of LAMP-ICTS注:1:鴨;2:羊;3:豬;4:雞;5:兔;6:驢;7:馬;8:鵝;9:狗;10:鴿子。

2.5 LAMP-ICTS檢測(cè)實(shí)際樣品

鴨源性成分為羊肉及其制品中較常見的摻假成分[4],采用本研究建立的LAMP-ICTS方法對(duì)超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等地采集的20份肉樣品進(jìn)行鴨源性成分檢測(cè),并與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法相比較,兩種方法的檢測(cè)結(jié)果如表2所示。所采集的5份羊肉片樣品(樣品編號(hào):1～5)中有2份檢測(cè)出鴨肉成分;所采集的5份熟制羊肉制品(樣品編號(hào):6～10)中未檢測(cè)到鴨肉成分;所采集的5份羊肉串(樣品編號(hào):11～15)中有3份檢測(cè)出鴨肉成分。新鮮的鴨肉及熟制的鴨肉中均檢測(cè)出鴨源性成分。本研究采集的少量羊肉樣品中有鴨源性成分檢出,表明市售的羊肉制品中確實(shí)存在摻假現(xiàn)象。此外,LAMP-ICTS檢測(cè)結(jié)果與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)結(jié)果一致,因此本研究建立的方法具有很好的準(zhǔn)確性。

表2 實(shí)際食品樣品檢測(cè)結(jié)果Table 2 Testing results of real food sample

3 結(jié)論

羊肉及其制品因其獨(dú)特的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值備受消費(fèi)者青睞。但不法商販為牟取更高的利益,常常用價(jià)值較低的鴨肉代替羊肉,這種行為嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)利益。本研究通過恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)合試紙條檢測(cè),建立了LAMP-ICTS法檢測(cè)羊肉及其制品中的鴨源性成分的新方法。本方法可以快速準(zhǔn)確的檢測(cè)羊肉及其制品中0.01%的鴨源性成分,完成整個(gè)檢測(cè)過程僅需40 min。利用20種市售羊肉、鴨肉樣品評(píng)價(jià)LAMP-ICTS方法的準(zhǔn)確性,結(jié)果顯示LAMP-ICTS方法與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法(PCR-電泳)的檢測(cè)結(jié)果一致。本研究建立的方法操作簡(jiǎn)單、對(duì)儀器的依賴程度低(僅需要一臺(tái)數(shù)字化恒溫水浴鍋),可作為肉及其制品中摻假成分鑒別檢測(cè)的有效工具。通過改變LAMP引物,可將LAMP-ICTS方法應(yīng)用于其他摻假肉類品種的檢測(cè),即LAMP-ICTS方法在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域會(huì)有更大的應(yīng)用前景。