華南忍冬總酚酸提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

李 潔,宮路路,王 剛,崔霖蕓,劉 亮 ,柳陳堅(jiān)

(1.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校,貴州遵義 563000;2.遵義醫(yī)科大學(xué),貴州遵義 563000;3.昆明理工大學(xué),云南昆明 650500)

華南忍冬(Loniceraconfusa)是忍冬科忍冬屬半常綠藤本植物,其花是藥食兩用植物山銀花的主要來源之一[1]。華南忍冬具有抗菌消炎、清熱解毒的功效[2-3],在臨床上主要用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫?zé)岚l(fā)病等癥狀[4-6]。現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于日化、飲料、美容、保健品等領(lǐng)域[7-8]。

酚酸類化合物是華南忍冬的有效成分,主要包括綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸等化合物,《中國藥典》2015版將綠原酸規(guī)定為山銀花質(zhì)量控制的主要指標(biāo)[9]。酚酸類化合物具有多種生物活性,主要表現(xiàn)在清除自由基、舒張血管、抗癌、抗病毒、抗菌消炎、抗過敏等方面[10]。

傳統(tǒng)提取中藥有效成分的方法存在耗時(shí)長、效率低、溫度較高等問題[11-14]。張忠斌等[15]分別采用改良石硫法、正丁醇萃取法、乙醇回流提取法和水提醇沉法提取金銀花中酚酸類成分,發(fā)現(xiàn)改良石硫法提取含量最高,達(dá)到68.87±1.25 mg/mL,但該方法耗時(shí)長且操作繁瑣,效率不高;趙佳鑫等[16]采用乙醇回流法提取灰氈毛忍冬總酚酸,其含量為61.716 mg/mL,但該方法的提取溫度較高,達(dá)到90 ℃。張百霞等[17]采用乙醇回流法,其最佳溫度也達(dá)到82 ℃。微波提取技術(shù)在傳統(tǒng)提取工藝的基礎(chǔ)上強(qiáng)化傳熱、傳質(zhì)過程,具有提取速度快、效率高、質(zhì)量好等特點(diǎn)[18-19]。目前,華南忍冬總酚酸微波輔助提取工藝未見文獻(xiàn)報(bào)道,故本論文以華南忍冬為原料,運(yùn)用微波提取法提取華南忍冬總酚酸,并結(jié)合單因素和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝參數(shù),同時(shí)通過DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力考查華南忍冬提取物體外抗氧化活性,以期為華南忍冬的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

華南忍冬 購于買綏陽縣藥材市場,由生藥教研室張玉金副教授鑒定為真品;綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品 純度98%，中國藥品生物品檢定所(生產(chǎn)批號:BW1811);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上海浩然生物技術(shù)有限公司;槲皮素(QUE)、維生素C(VC) 華中藥業(yè)股份有限公司;鐵氰化鉀、三氯化鐵、十二烷基硫酸鈉、無水乙醇、鹽酸、甲醇、乙腈、冰醋酸、三氯乙酸、無水乙酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、槲皮素 均為國產(chǎn)分析純。

XH-100A型微波催化合成提取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;SC-3614型低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;DK-98-Ⅰ型電子恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;AL204型電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;RE-52 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮儀器公司;TU-1901型雙光束紫外分光光度計(jì) 北京普析通有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 華南忍冬中總酚酸的提取 將準(zhǔn)確稱取的5.00 g華南忍冬干品放入250 mL的圓底燒瓶中,并添加不同體積的無水乙醇,采用微波輔助提取華南忍冬總酚酸,在設(shè)定的功率和溫度下加熱回流提取一段時(shí)間,然后提取液冷卻至室溫后抽濾,收集濾液至500 mL容量瓶中,加無水乙醇定容,并放置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時(shí)間和微波功率5個(gè)條件為研究對象,以華南忍冬中總酚酸含量為考察指標(biāo)。

1.2.2.1 乙醇濃度對華南忍冬總酚酸含量的影響 設(shè)定微波功率為400 W,微波提取時(shí)間為30 min,溫度70 ℃,液料比12∶1 mL/g,分別在乙醇濃度為20%、40%、60%、80%、100% 5個(gè)梯度下,研究乙醇濃度對華南忍冬總酚酸含量的影響。

1.2.2.2 提取溫度對華南忍冬總酚酸含量的影響 設(shè)定微波功率400 W,提取時(shí)間30 min,乙醇濃度為80%,液料比12∶1 mL/g,分別在溫度為50、60、70、80、90 ℃ 5個(gè)梯度下,研究提取溫度對華南忍冬總酚酸含量的影響。

1.2.2.3 提取時(shí)間對華南忍冬總酚酸含量的影響 設(shè)定微波功率為400 W,乙醇濃度為80%,液料比12∶1 mL/g,溫度70 ℃,分別在時(shí)間為10、20、30、40、50 min 5個(gè)時(shí)間段下,研究提取時(shí)間對華南忍冬總酚酸含量的影響。

1.2.2.4 微波功率對華南忍冬總酚酸含量的影響 設(shè)定溫度70 ℃,提取時(shí)間30 min,80%乙醇,液料比12∶1 mL/g,分別在微波功率為100、200、300、400、500 W 5個(gè)梯度下,研究微波功率對華南忍冬總酚酸含量的影響。

1.2.2.5 液料比對華南忍冬總酚酸含量的影響 設(shè)定微波功率為400 W,提取時(shí)間30 min,溫度70 ℃,乙醇濃度為80%,分別在液料比為8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1 mL/g 5個(gè)梯度下,研究液料比對華南忍冬總酚酸含量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 采用Box-Behnken的中心組合原理為依據(jù),以提取溫度(A)、微波功率(B)和液料比(C)為自變量,總酚酸的含量為因變量,采用3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝,并建立數(shù)學(xué)回歸模型，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels tabe of response surface experiment

1.2.4 微波提取法與其他提取方法的比較 本文將微波輔助提取法與傳統(tǒng)的2種提取方法相比較,以總酚酸含量為考察指標(biāo),比較三種提取方法之間的差異。

1.2.4.1 乙醇回流法 取5.00 g華南忍冬,加100 mL 80%乙醇,在80 ℃加熱回流3次,每次1 h,過濾并合并濾液,收集濾液至500 mL容量瓶中,加80%乙醇定容,備用[15]。

1.2.4.2 浸漬法 取5.00 g華南忍冬,加入300 mL 80%乙醇,浸漬12 h,過濾,收集濾液至500 mL容量瓶中,加80%乙醇定容,備用[20]。

1.2.5 華南忍冬總酚酸含量測定

1.2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的綠原酸對照品5.2 mg,加適量無水乙醇溶解,定容于25 mL的容量瓶中,振蕩均勻,并放置于冰箱保存?zhèn)溆?以每1 mL中含綠原酸0.2 mg)[20]。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取綠原酸對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL至25 mL棕色容量瓶中,加無水乙醇至5 mL,搖勻后加0.3%十二烷基硫酸鈉溶液2 mL及0.6%三氯化鐵-0.9%鐵氰化鉀(1∶0.9)混合溶液1 mL,混勻,暗處放置5 min,用0.1 mol/L鹽酸定容至25 mL,以不加樣品的顯色劑為空白,在762 nm波長處測定吸光度(A)[21]。以綠原酸濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得線性回歸方程y=0.0749x+0.3023(R2=0.9991)。結(jié)果表明,綠原酸在0.83～4.16 μg/mL與吸光度呈良好線性關(guān)系。華南忍冬總酚酸含量計(jì)算以綠原酸計(jì)。

1.2.5.3 總酚酸含量的計(jì)算 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算公式如下:

華南忍冬總酚酸含量(mg/g)=c×V×10-3/m

式中:c為提取液中華南忍冬總酚酸的濃度,μg/mL;V為華南忍冬總酚酸提取液體積,mL;m為華南忍冬質(zhì)量,g。

1.2.6 華南忍冬總酚酸體外抗氧化試驗(yàn)

1.2.6.1 華南忍冬總酚酸對DPPH自由基清除率的測定 將華南忍冬提取物、對照品槲皮素和維生素C分別加無水乙醇配制成濃度為1.44、2.88、5.76、11.52、23.04 μg/mL的樣品溶液。分別精密移取2 mL樣品溶液于15 mL試管中,加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL,充分混勻,室溫下避光反應(yīng)30 min,于517 nm波長處測定其吸光度,記為Ai。同時(shí)測定不含樣品的溶液作為空白對照Ac,平行測量3次[22]。以樣品濃度為自變量,吸光度值為因變量作圖并進(jìn)行線性擬合,計(jì)算IC50值,其中IC50值定義為清除率為50%時(shí)所需抗氧化劑的濃度,所需濃度越低,表明該物質(zhì)抗氧化性越強(qiáng)[23]。

DPPH自由基清除率(%)=(1-Ai/Ac)×100

1.2.6.2 鐵離子還原能力的測定 采用普魯士藍(lán)還原法,參考代沙的研究方法做了調(diào)整[24]。取1.2 mL稀釋后的華南忍冬提取液、對照品槲皮素和維生素C,加pH=6.6的磷酸緩沖液1.0 mL和1%鐵氰化鉀溶液1.0 mL,混合后在50 ℃放置20 min。然后反應(yīng)液急速冷卻,加入10%三氯乙酸2.5 mL混合,用蒸餾水定容到10 mL。將樣品以3000 r/min速度離心10 min,取上清夜2.5 mL加入0.1%三氯化鐵0.5 mL,混勻后用蒸餾水定容到5 mL,暗處放置10 min,在700 nm波長處測定吸光度A[25]。試劑空白為參比溶液。吸光度越高,抗氧化性越好,還原能力越強(qiáng)。以樣品濃度為自變量,吸光度值為因變量作圖并進(jìn)行線性擬合,計(jì)算EC50值,其中EC50值定義為能引起50%最大效應(yīng)的濃度,所需濃度越低,表明該物質(zhì)抗氧化性越強(qiáng)[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Origin 8.0及Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對總酚酸含量的影響 圖1可以看出,隨著乙醇濃度的增加,總酚酸含量逐漸增加,說明目標(biāo)成分更易溶解于乙醇溶液中,但乙醇濃度達(dá)到80%時(shí),繼續(xù)提高濃度,總酚酸含量下降,說明當(dāng)乙醇濃度過高,出現(xiàn)一些脂溶性雜質(zhì),例如甾醇類或黃酮類化合物,從而使總酚酸的總酚酸含量下降[16]。由以上結(jié)果分析,在乙醇濃度為80%時(shí),達(dá)到最大值,若繼續(xù)增加乙醇濃度進(jìn)行響應(yīng)面考察,除了影響總酚酸含量,樣品后處理也非常困難。因此,本實(shí)驗(yàn)選取80%乙醇提取總酚酸。

圖1 乙醇濃度對華南忍冬總酚酸含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on total phenolic acid content of Lonicera confusa

2.1.2 提取溫度對總酚酸含量的影響 由圖2可看出,隨著溫度的升高,總酚酸含量逐漸增加,可能是分子熱運(yùn)動(dòng)的原因加快了酚酸類化合物溶解到溶液中;溫度到達(dá)70 ℃后,繼續(xù)升高,總酚酸含量下降,這是由于溫度過高,總酚酸中可能有一些成分結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而被破壞,含量降低[27]。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇在60～80 ℃的范圍內(nèi)通過響應(yīng)面方法優(yōu)化提取溫度。

圖2 提取溫度對華南忍冬總酚酸含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on total phenolic acid content of Lonicera confusa

2.1.3 提取時(shí)間對總酚酸含量的影響 由圖3可看出,隨著提取時(shí)間的增加,總酚酸含量逐漸增加,可能是酚酸類化合物被溶劑從植物細(xì)胞中溶解到溶液中需要一定時(shí)間,隨著時(shí)間的延長,總酚酸含量基本沒有明顯變化。因此,從結(jié)果看出在30 min時(shí),總酚酸含量達(dá)到最大值,若繼續(xù)增加提取時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面考察,總酚酸含量變化小,同時(shí)會增加大量能耗,故選擇最佳提取時(shí)間為30 min。

圖3 華南忍冬提取物、槲皮素(QUE)、維生素C(VC)的抗氧化活性比較Fig.3 Antioxidant effects of the extracts of Lonicera confuse flower,quercetin(QUE),and ascorbic acid(VC)注:A. DPPH自由基清除能力;B.鐵離子還原能力。

圖3 提取時(shí)間對華南忍冬總酚酸含量的影響Fig.3 Effect of extraction time on total phenolic acid content of Lonicera confusa

2.1.4 微波功率對總酚酸含量的影響 由圖4可看出,隨著微波功率逐漸增加,總酚酸含量逐漸增加,可能是高頻電磁波穿透該植物細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部,通過微波能使細(xì)胞內(nèi)部的溫度迅速上升,導(dǎo)致細(xì)胞破裂,其內(nèi)的酚酸類化合物自由流出;但微波功率超過400 W后,總酚酸含量下降,經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn),推斷是當(dāng)微波功率過高時(shí),溫度不易控制,同時(shí)反應(yīng)體系溫度開始上升,因而總酚酸含量下降[27]。因此,在響應(yīng)面分析中,選擇在300～500 W的范圍內(nèi)優(yōu)化微波功率。

圖4 微波功率對華南忍冬總酚酸含量的影響Fig.4 Effect of microwave power on total phenolic acid content of Lonicera confusa

2.1.5 液料比對總酚酸含量的影響 由圖5可看出,當(dāng)液料比在8∶1～12∶1 mL/g的范圍內(nèi)時(shí),總酚酸含量逐漸增加;在液料比超過12∶1 mL/g,總酚酸含量下降。可能隨著溶劑量的增加,大量雜質(zhì)從華南忍冬中析出,例如黃酮類化合物,從而降低了總酚酸的含量[28]。因此,選擇在10∶1～14∶1 mL/g的范圍內(nèi)進(jìn)一步通過響應(yīng)面分析。

圖5 液料比對華南忍冬總酚酸含量的影響Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on total phenolic acid content of Lonicera confusa

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型建立與分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果,以Box-Behnken的中心組合原理為依據(jù),進(jìn)一步詳細(xì)考察提取溫度(A)、微波功率(B)和液料比(C)相互之間對華南忍冬總酚酸含量的影響,利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件Design Expert 8.0.6軟件建立數(shù)字回歸模型,確定華南忍冬中總酚酸最佳提取工藝條件,結(jié)果見表2。得回歸方程:

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The analysis results of response surface experiment

Y(mg/g)=57.76-1.18A-0.77B+2.22C-2.81AB+0.61AC+0.12BC-13.92A2-14.49B2-18.30C2

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Analysis results of regression and variance

模型中因素一次項(xiàng)C,交互項(xiàng)AB二次項(xiàng)A2、B2和C2對華南忍冬總酚酸含量有高度顯著的影響(P<0.001),一次項(xiàng)A對華南忍冬總酚酸的含量有極顯著影響(P<0.01),一次項(xiàng)B對華南忍冬總酚酸的含量有顯著影響(P<0.05),各因素對華南忍冬中總酚酸含量的影響依次為:液料比(C)>提取溫度(A)>微波功率(B)。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 各因素交互作用對華南忍冬總酚酸含量影響的響應(yīng)曲面如圖6所示。據(jù)圖6A所示為提取溫度與微波功率的交互影響效應(yīng),由三維曲線圖可看出,在提取溫度較低時(shí),總酚酸含量逐漸增加,之后趨于減少。由于酚酸類化合物含有酚羥基,可能在高溫情況下發(fā)生氧化等反應(yīng),而使總酚酸含量減小。在300～400 W范圍內(nèi),總酚酸含量隨著溫度升高而增加,當(dāng)超過400 W后,含量逐漸減少。并且微波功率和提取時(shí)間的交互對響應(yīng)值的影響顯著(P<0.05)。

圖6B顯示了微波功率為零水平時(shí)液料比和提取溫度之間的交互影響效應(yīng),液料比例較低時(shí),總酚酸含量隨液料比例增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;提取溫度較高時(shí),總酚酸含量隨溫度升高呈下降趨勢,溫度越高,下降幅度越大。雖然液料比和提取溫度對響應(yīng)值而言都具有顯著影響,但二者交互對響應(yīng)值的影響不顯著(P>0.05)。

圖6C顯示了提取溫度為零水平,液料比與微波功率對總酚酸含量的影響和兩者之間的交互作用。微波功率較低時(shí),總酚酸含量隨功率增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;液料比例較高時(shí),總酚酸含量隨液料比增加呈下降趨勢,液料比例越大,下降幅度越大。雖然液料比和提取功率對響應(yīng)值而言都具有顯著影響,但二者交互對響應(yīng)值的影響不顯著(P>0.05)。

圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot of interaction of various factors

2.3 最佳工藝驗(yàn)證

通過響應(yīng)面軟件中回歸模型得出所考察的三個(gè)因素最佳條件為:微波功率398.20 W,提取溫度69.35 ℃,液料比12.14∶1 mL/g,總酚酸含量預(yù)測值57.76 mg/g。經(jīng)實(shí)際調(diào)整,確定總酚酸最佳提取工藝條件:乙醇濃度80%,微波功率400 W,提取溫度70 ℃,提取時(shí)間為30 min,液料比12∶1 mL/g,以此條件進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn),測得華南忍冬總酚酸的含量為59.45±0.13 mg/g,RSD=0.94%,由此可說明模型和方法的可行性和有效性良好。

2.4 與傳統(tǒng)提取方法相比

本研究將傳統(tǒng)2種提取方法與微波輔助提取法以總酚酸含量為考察指標(biāo)進(jìn)行了對比。如表4所示,通過微波輔助提取法與2種提取方法的比較,發(fā)現(xiàn)該方法不僅增加了提取效率(總酚酸含量提高了近2倍),還顯著地降低了提取時(shí)間(從12 h降低到0.5 h)。以上結(jié)果表明,微波輔助提取法具有巨大的潛力,有望成為一種從華南忍冬中快速、高效、綠色的提取總酚酸的方法。

表4 不同提取方法提取效果的影響(n=3)Table 4 Effect of different extraction methods on the extraction yield of total phenolic acids(n=3)

2.5 體外抗氧化活性

2.5.1 對DPPH自由基的清除能力 不同濃度的華南忍冬提取物(總酚酸含量為60.23 mg/g)、槲皮素、維生素C對DPPH自由基清除能力如圖7A所示。3種物質(zhì)在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對DPPH自由基的清除能力呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,即隨著濃度的增加,清除率也隨之增加,并且3種物質(zhì)在相同濃度下抑制自由基的能力有所差異。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),華南忍冬提取物、槲皮素、維生素C的IC50分別為21.26、8.08、13.19 μg/mL。因此,抗氧化活性大小順序?yàn)?槲皮素>維生素C>華南忍冬提取物。通過與文獻(xiàn)中桑葉酚酸提取物(IC50=4690 μg/mL)和棕筍酚酸提取物(IC50=690 μg/mL)相比較[30-31],發(fā)現(xiàn)華南忍冬提取物具有較好的清除自由基的能力。

2.5.2 鐵離子還原能力 華南忍冬提取物(總酚酸含量為60.23 mg/g)、槲皮素、維生素C的還原能力測試結(jié)果如圖7B所示,3種物質(zhì)均有不同程度的還原能力,槲皮素、華南忍冬提取物、維生素C的EC50值分別為28.74、39.37、36.28 μg/mL。EC50值越低,表明該物質(zhì)還原能力越強(qiáng)。其還原能力強(qiáng)弱順序?yàn)?槲皮素>維生素C>華南忍冬提取物。并與文獻(xiàn)[32-33]中其它植物的酚酸提取物相比較,鐵離子還原能力分別是鼠尾草提取物的10倍和木賊提取物的3倍,說明該提取物具有較好的還原能力。

抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,華南忍冬提取物具有潛在的抗氧化活性,原因可能是華南忍冬含有豐富的酚酸類化合物。

3 結(jié)論

本課題通過微波提取法對華南忍冬總酚酸的提取工藝進(jìn)行了研究,分別評價(jià)了乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時(shí)間及微波功率 5個(gè)因素對華南忍冬總酚酸提取率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了華南忍冬總酚酸提取工藝,最佳的工藝條件為乙醇濃度為80%、液料比為12∶1 mL/g、提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間為30 min、微波功率為400 W。在此條件下,華南忍冬總酚酸的提取率達(dá)到最大值為59.45 mg/g,與模型預(yù)測值57.76 mg/g相近。同時(shí)研究了華南忍冬總酚酸對DPPH自由基的清除能力和鐵離子還原能力的影響。結(jié)果表明,華南忍冬總酚酸的DPPH自由基清除 IC50為21.26 μg/mL,而鐵離子還原能力的EC50為39.37 μg/mL,華南忍冬總酚酸具有一定的抗氧化能力。以上研究為華南忍冬藥材的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。