特種油脂納米乳液超聲制備工藝優(yōu)化及其特性研究

高 巍,白新鵬,,*,劉亞文,,時(shí)振振,何坤明,,王國錠,孫光友

(1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,熱帶多糖資源利用教育部工程研究中心,海南海口 570203;2.海南大白康健醫(yī)藥股份有限公司,海南?？?570203)

含功能性成分的食品和飲料產(chǎn)品更利于人體的健康,因此在食品加工中引起了越來越多的關(guān)注[1]。茶葉樹種子是目前茶葉生產(chǎn)的副產(chǎn)品,綠茶籽油是從中提取得到的一種油脂[2]。據(jù)研究,綠茶籽油的脂肪酸組成與橄欖油和山茶油相似[3],但綠茶籽油富含天然茶多酚,這一特征指標(biāo)不同于橄欖油和山茶油,因此具有更高的食用價(jià)值。椰子油是各種甘油三酸酯的混合物,月桂酸含量超過50%,C6、C8和C10脂肪酸含量超過15%。因此,它被認(rèn)為是中鏈脂肪酸最豐富的來源。此外,初榨椰子油(VCO)保留了大量天然活性物質(zhì),例如維生素、多酚和植物甾醇,因?yàn)樗峭ㄟ^使用冷榨方法從新鮮成熟的椰子漿中獲得的,無需加熱和精煉[4-6],具有抗氧化、抗血栓和消炎作用[7-10]。然而,VCO的熔點(diǎn)為25～27 ℃,較易凝固,這一特點(diǎn)限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。溫度梯度場分提是一種使油脂在恒定溫差下連續(xù)結(jié)晶的方法,油脂中的甘油酯分子可以在非等溫環(huán)境中保持多自由度運(yùn)動,具有較高熔點(diǎn)的分子有足夠的時(shí)間在溫度梯度場中形成晶核。通過這種方法,可以得到具有高熔點(diǎn)和高純度的固體提取物,并且可以將VCO進(jìn)行物理分提以獲得分提椰子油[11]。在這項(xiàng)研究中,使用綠茶籽油及實(shí)驗(yàn)室利用自行開發(fā)的專利設(shè)備制備的分提椰子油組成混合油相,在綠茶籽油良好的脂肪酸組成和含量較高的茶多酚的基礎(chǔ)上引入富含中短鏈脂肪酸的分提椰子油,使油相的中短鏈脂肪酸含量更高,同時(shí)使其中的天然活性物質(zhì)更加多樣化,并探索制備的新型功能油脂在納米乳液體系中的應(yīng)用。

基于納米顆粒的遞送系統(tǒng)的開發(fā)一直是食品工業(yè)中納米技術(shù)最重要的應(yīng)用之一[12]。納米乳液較小的液滴尺寸增強(qiáng)了各種疏水性食品成分的傳遞、溶解度和生物利用度[13]。由于納米載體的尺寸非常小,因此具有提高水溶性,增加在胃腸道中的停留時(shí)間,改善在胃腸道中的理化穩(wěn)定性,增加腸道滲透性和控制釋放的優(yōu)點(diǎn)[14]。納米載體系統(tǒng)已在世界范圍內(nèi)得到廣泛的研究,用于親脂性保健食品的研發(fā)。目前,關(guān)于超聲法制備納米乳液以及表面活性劑和超聲條件對納米乳液的穩(wěn)定性和生物利用度的影響的研究備受關(guān)注。超聲波處理可用于制備粒徑大小在30～600 nm之間的納米乳液[15]。當(dāng)納米載體用于食品加工或口服給藥系統(tǒng)時(shí),其配方要具有穩(wěn)定、無毒、易于吸收的特點(diǎn),并且能夠適用于各種食品加工條件[12]。用于形成和穩(wěn)定納米乳液的食品級表面活性包括合成表面活性劑和天然表面活性劑,有時(shí)組合使用以形成復(fù)合納米顆粒[16]。合成表面活性劑具有高效促進(jìn)納米液滴形成的能力,但其毒性限制了其在食品級納米乳液中的使用。因此,天然表面活性劑在食品加工中的應(yīng)用研究受到廣泛關(guān)注。據(jù)報(bào)道,皂苷、磷脂、多糖和蛋白質(zhì)都可以作為表面活性劑用于制備納米乳液[17-19]。表面活性劑對納米乳液的特性具有重要的影響[20]。因此,有必要對天然表面活性劑對納米乳液功能特性的影響進(jìn)行研究,以便通過根據(jù)不同的生產(chǎn)需求選擇最合適的表面活性劑含量來制備適合食品工業(yè)的納米乳液。特種油脂在納米乳液中的應(yīng)用前景廣闊,其本身的營養(yǎng)成分和功能特性可以提高納米乳液的營養(yǎng)價(jià)值。綠茶籽油和分提椰子油作為新型功能油脂,可以用于制備富含中短鏈脂肪酸和天然活性物質(zhì)的納米乳液,在納米乳液體系的構(gòu)建中具有較高的應(yīng)用價(jià)值和很大的應(yīng)用潛力,研究其在納米乳液中的應(yīng)用具有很好的現(xiàn)實(shí)意義。然而,關(guān)于在超聲法制備納米乳液中表面活性劑含量和超聲條件對納米乳液穩(wěn)定性和生物利用度的影響的研究很少。

本研究的目的是利用溫度梯度場法對初榨椰子油進(jìn)行分提,得到改善熔點(diǎn)和提高中短鏈脂肪酸比例的分提椰子油,然后與綠茶籽油組成特種功能油脂作為油相制備納米乳液。用響應(yīng)面對超聲法制備納米乳液的工藝進(jìn)行優(yōu)化,使用大豆卵磷脂作為表面活性劑,研究表面活性劑濃度對納米乳液平均粒徑和Zeta-電位的影響,并對納米乳液的穩(wěn)定性和體外消化特性進(jìn)行評價(jià)。研究的結(jié)果將對于開發(fā)和生產(chǎn)天然表面活性劑穩(wěn)定的含功能油脂的納米乳液體系奠定理論基礎(chǔ),制備的納米乳液體系有望為食品工業(yè)的生產(chǎn)和加工提供優(yōu)質(zhì)的原料。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

綠茶籽油、初榨椰子油 海南大白康健醫(yī)藥股份有限公司提供;大豆卵磷脂(PC≥90%)、胃蛋白酶(USP級,1∶30000)、胰酶(BR,1∶4000)、豬膽鹽(含量≥60%)、膽酸鹽(含量≥60%)、NaCl(AR,99.5%)、CaCl2(AR,99.5%)、37種脂肪酸甲酯混標(biāo)(分析標(biāo)準(zhǔn)品) 上海源葉生物科技有限公司;正己烷(色譜級)、乙酸乙酯(分析純)、草酸(分析純)、甲酸鈉(分析純)、甲醇(分析純) 廣州化學(xué)試劑公司。

ZEN3690馬爾文激光粒度儀 英國Malvern公司;T10 basic手持均質(zhì)機(jī) 德國IKA;KQ-800KDE型超聲波破碎儀 昆山市超聲儀器有限公司;MLR-351恒溫培養(yǎng)箱 日本SANYO公司;SHZ-B恒溫?fù)u床 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 椰子油分提及脂肪酸組成分析 使用溫度梯度場分提設(shè)備(圖1)對VCO進(jìn)行分提。溫度梯度場裝置主要由溫度控制系統(tǒng)、超聲波發(fā)生器、雙層表面結(jié)晶器和螺旋管加熱器組成[11]。將2 L VCO倒入雙層表面結(jié)晶器中,螺旋管加熱器的溫度保持在35 ℃,并通過循環(huán)水溫控制系統(tǒng)將10 ℃的恒溫水注入雙層表面結(jié)晶器中,將超聲波發(fā)生器的功率保持在60 W,結(jié)晶時(shí)間2 h,然后分離出未結(jié)晶的部分,得到分提椰子油。使用氣相色譜法對分提椰子油的脂肪酸組成進(jìn)行分析[21]。

圖1 溫度梯度場分提VCO實(shí)驗(yàn)裝置原理圖Fig.1 Schematic diagram of the experimental device used for coconut oil extraction with gradient temperatures注:1:溫度控制系統(tǒng);2:雙層表面結(jié)晶器;3:溫度控制系統(tǒng);4:加熱裝置;5:超聲波發(fā)生器;6:螺旋管加熱器;7:制冷裝置。

脂肪酸甲酯化:取適量樣品,向其中加入1.5 mL正己烷(色譜級),然后依次加入40 μL乙酸乙酯、100 μL 0.5 mol/L甲酸鈉-甲醇溶液,混合均勻。37 ℃保存20 min后,于-15 ℃下保存10 min,加入60 μL草酸產(chǎn)生沉淀后以4000 r/min離心5 min,取上清液,用無水硫酸鈉柱對上清液進(jìn)行脫水,然后通過0.22 μm濾膜過濾后保存于進(jìn)樣瓶中,氮?dú)獯蹈?再加入1 mL正己烷(色譜級)溶解,待測。

氣相色譜條件:載氣:H2,燃燒氣:H2、N2,使用的毛細(xì)血管柱的規(guī)格為:100 m×0.25 mm×0.2 μm cp-sil88。進(jìn)樣口溫度:250 ℃,起始溫度:45 ℃,保持4 min,然后以13 ℃/min的速度升溫到175 ℃,再保持27 min,之后以4 ℃/min的速度升溫到215 ℃,保持35 min。脂肪酸組成的分析參照 GLC-463脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)圖譜,使用面積歸一化法確定脂肪酸百分含量。

1.2.2 納米乳液及粗乳液的制備 納米乳液:將綠茶籽油和分提椰子油在60 ℃的恒溫水浴中保持30 min,以消除其晶體結(jié)構(gòu)。然后將綠茶籽油和分提椰子油以3∶2的比例混合,使用磁力攪拌器混合30 min,然后超聲處理15 min得到混合油相。用10 wt%的混合油相與90 wt%的水相制備O/W型納米乳液。水相由表面活性劑(大豆卵磷脂)和磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L磷酸鈉緩沖液,pH7.0)組成,研究中所有的表面活性劑濃度均是以有效成分的含量表示。在制備之前用磁力攪拌器攪拌12 h使表面活性劑充分水化。將油相和水相用高速均質(zhì)機(jī)在20000 r/min條件下預(yù)均質(zhì)2 min,然后在不同超聲功率下分別超聲處理不同時(shí)間得到O/W型納米乳液。為了避免在實(shí)驗(yàn)過程中由于超聲處理而引起的體系溫度升高的現(xiàn)象,在超聲過程中所有納米乳液均通過冰浴冷卻以保持乳化過程在室溫(25 ℃)下進(jìn)行。納米乳液制備完成后,在樣品中添加0.02 wt%的NaN2作為抗菌劑。

粗乳液:用10 wt%的混合油相與90 wt%的水相制備粗乳液。將油相和水相混合后使用高速均質(zhì)機(jī)在20000 r/min下預(yù)均質(zhì)2 min,然后在350 W超聲功率下超聲處理12 min得到粗乳液。為了避免在實(shí)驗(yàn)過程中由于超聲處理而引起的體系溫度升高的現(xiàn)象,在超聲過程中通過冰浴冷卻以保持乳化過程在室溫(25 ℃)下進(jìn)行。粗乳液制備完成后,在樣品中添加0.02 wt%的NaN3作為抗菌劑。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 表面活性劑濃度的確定 在超聲功率為320 W、超聲時(shí)間15 min,乳化溫度保持在室溫的條件下制備納米乳液,大豆卵磷脂的濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%。然后測定納米乳液的平均粒徑。

1.2.3.2 超聲功率的確定 在大豆卵磷脂濃度為2%、超聲時(shí)間15 min,乳化溫度保持在室溫的條件下制備納米乳液,超聲功率分別為160、240、320、400、480 W。然后測定納米乳液的平均粒徑。

1.2.3.3 超聲時(shí)間的確定 在大豆卵磷脂濃度為2%、超聲功率320 W,乳化溫度保持在室溫的條件下制備納米乳液,超聲時(shí)間分別為5、10、15、20、25 min。然后測定納米乳液的平均粒徑。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,使用響應(yīng)面分析的方法選取三因素三水平對納米乳液的平均粒徑進(jìn)行優(yōu)化(A、B、C分別代表表面活性劑含量、超聲功率、超聲時(shí)間),如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Design of factors and levels in the response surface

1.2.5 平均粒徑的測定 使用激光粒度儀測量納米乳液的平均粒徑。分析之前,將樣品用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L,pH7.0)稀釋500倍,以避免多重散射效應(yīng),納米乳液的折射率為1.46,磷酸鹽緩沖液的折射率為1.33[18]。

1.2.6 Zeta-電位的測定 使用馬爾文激光粒度儀測定Zeta-電位。為避免多重散射效應(yīng),在分析之前,將樣品用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L,pH7.0)稀釋500倍[18]。

1.2.7 納米乳液穩(wěn)定性分析

1.2.7.1 pH穩(wěn)定性 將5 mL新制備的納米乳液放入不同的玻璃燒杯中,并用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液將樣品調(diào)節(jié)至不同的pH(3～8)。然后將樣品轉(zhuǎn)移到試管中保存以便分析,樣品在室溫下保存24 h后,測量平均粒徑和Zeta-電位。

1.2.7.2 熱處理穩(wěn)定性 將5 mL新制備的納米乳液轉(zhuǎn)移到不同的密封玻璃試管中,在水浴鍋中以不同的熱處理溫度(40～80 ℃)水浴加熱30 min,然后將玻璃試管放入冰水浴中冷卻至室溫。將樣品在室溫下保存24 h后,測量平均粒徑和Zeta-電位。

1.2.7.3 離子強(qiáng)度穩(wěn)定性 將2 mL新制備的納米乳液置于不同的玻璃試管中,并通過添加2 mL鹽溶液(NaCl溶液)將最終離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)為0.1～0.5 mol/L。樣品在室溫下保存24 h后,測量平均粒徑和Zeta-電位。

1.2.7.4 貯藏穩(wěn)定性 將5 mL新制備的納米乳液轉(zhuǎn)移到不同的密封試管中,分別貯藏在不同的環(huán)境溫度下(5、27、50 ℃),在不同貯藏時(shí)間時(shí)(5、15、30、45 d)測量納米乳液的平均粒徑和Zeta-電位。

1.2.8 模擬胃、腸消化實(shí)驗(yàn) 使用國際通用的方法[22]對胃腸道環(huán)境進(jìn)行模擬,包括模擬胃液和模擬小腸階段,以研究納米乳液的體外消化過程。通過對模擬小腸消化階段中游離脂肪酸(FFA)的釋放率來評價(jià)納米乳液的體外消化率。

模擬胃液階段:將5 mL的納米乳液轉(zhuǎn)移至不同的棕色玻璃試管中,分別加入5 mL 超純水、7.5 mL模擬胃液(SGF)、5 μL CaCl2(0.3 mol/L)和HCl(2 mol/L)達(dá)到pH3。然后,加入1.6 mL含胃蛋白酶的SGF溶液,使最終模擬胃相中的酶活性達(dá)到2000 U/mL,胃相總體積為20 mL。將樣品置于恒溫水浴振蕩器中在36 ℃水浴中振蕩2 h。

模擬小腸階段:向模擬胃液消化后的胃相中加入11 mL模擬腸液(SIF),然后加入2.5 mL豬膽鹽溶液(0.16 mol/L)和40 μL CaCl2(0.3 mol/L),使用NaOH(1 mol/L)溶液調(diào)節(jié)到pH7。然后,加入5 mL酶活性為1600 U/mL的胰酶溶液使模擬腸液中的最終胰酶活性為200 U/mL。模擬腸液的最終體積為40 mL。將樣品置于恒溫水浴振蕩器中在36 ℃水浴中振蕩。在模擬小腸階段,研究了不同消化時(shí)間油脂的消化程度,分別在加入胰酶溶液振蕩7.5、15、30、45、60、90和120 min時(shí)測定了FFA釋放率。

FFA釋放率可以通過消耗的NaOH的體積計(jì)算:

式中:FFAs:游離脂肪酸釋放率,%;Mlipid:乳液中脂肪的總質(zhì)量,g;VNaOH:所消耗的NaOH溶液的體積,L;mNaOH:滴定時(shí)選用NaOH溶液的濃度,mol/L;Mlipid:脂肪分子的平均分子量,g/mol。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用分析軟件(SPSS 20.0,SPSS Inc.,Chicago,IL)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Tukey檢驗(yàn)用于通過單向方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)來確定平均值之間的顯著差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分提椰子油脂肪酸組成分析

使用氣相色譜法對分提椰子油的脂肪酸組成進(jìn)行了分析,分提椰子油的脂肪酸組成如表2所示。溫度梯度場分提后的分提椰子油的C8和C10脂肪酸含量明顯提高,中短鏈脂肪酸的比例上升,長鏈脂肪酸的含量下降,使其更容易被快速吸收并且不易凝固。分提椰子油相比于初榨椰子油,其脂肪酸組成和熔融特性得到了很好地改善,有潛力成為一種新型的功能油脂。

表2 初榨椰子油和分提椰子油的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of virgin coconut oil and fractionated coconut oil

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 表面活性劑含量對納米乳液粒徑的影響 表面活性劑含量對納米乳液粒徑的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可知,當(dāng)表面活性劑的含量逐漸提高時(shí),納米乳液液滴的平均粒徑先明顯減小然后略微增大。當(dāng)表面活性劑的含量為2.0 wt%時(shí),平均粒徑最小,而后隨著表面活性劑含量的增加,平均粒徑有增大的趨勢,這可能是液滴表面附著的表面活性劑達(dá)到峰值,過多的表面活性劑吸附在液滴上致使液滴的直徑變大[23]。因此,響應(yīng)面模型選取的表面活性劑含量的范圍是1.5～2.5 wt%。

圖2 表面活性劑含量對納米乳液平均粒徑的影響Fig.2 Effect of surfactant contents on the average particle size of nanoemulsions

2.2.2 超聲功率對納米乳液粒徑的影響 超聲功率對納米乳液粒徑的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,隨著超聲功率的增大,平均粒徑先減小然后增大,當(dāng)超聲功率為320 W時(shí),納米乳液液滴的平均粒徑達(dá)到最小值,此時(shí)超聲處理提供的空化能有利于納米乳液液滴的形成。然而,當(dāng)超聲功率過高時(shí)會因?yàn)橐旱伍g的碰撞過于頻繁而破壞液滴的結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致平均粒徑的增大。因此,響應(yīng)面模型選取的超聲功率范圍為240～400 W。

圖3 超聲功率對納米乳液平均粒徑的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the average particle size of nanoemulsions

2.2.3 超聲時(shí)間對納米乳液粒徑的影響 超聲時(shí)間對納米乳液平均粒徑的影響如圖4所示。由圖4可知,平均粒徑隨著超聲時(shí)間的增長先減小然后增大,在超聲時(shí)間為10 min時(shí)達(dá)到最小值,之后隨著超聲時(shí)間的增加而增大。這是因?yàn)楫?dāng)超聲時(shí)間過長時(shí)會導(dǎo)致納米乳液的過度超聲,納米乳液的液滴會被壞,從而導(dǎo)致納米乳液液滴平均粒徑的增大。因此,響應(yīng)面模型選擇的超聲時(shí)間范圍為5～15 min。

圖4 超聲時(shí)間對納米乳液平均粒徑的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the average particle size of nanoemulsions

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 回歸方程的建立及模型 響應(yīng)面結(jié)果見表3。方差分析由表4可知,實(shí)驗(yàn)選取的含綠茶籽油和分提椰子油納米乳液的平均粒徑模型不同處理間差異都極顯著(P<0.01),而失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),這說明了殘差均是由隨機(jī)誤差引起的。模型的擬合度R2達(dá)到0.9371,說明響應(yīng)值平均粒徑的變化有93.71%來自于所選自變量的變化,證明該模型擬合度較好,使用該模型能夠非?？煽康膶G茶籽油和分提椰子油納米乳液的平均粒徑進(jìn)行預(yù)測。經(jīng)回歸擬合后,得到回歸模型方程(A、B、C分別表示表面活性劑含量、超聲功率、超聲時(shí)間):

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface

表4 Z-Ave方差分析Table 4 ANOVA of Z-Ave

YZ-Ave=190.78-42.56A-27.07B-39.54C+8.65AB-9.93AC+7.45BC+49.50A2+26.37B2+55.30C2

由表4可知,在Z-Ave模型中,一次項(xiàng)A、B、C對平均粒徑的影響均達(dá)到極顯著水平(P<0.01),二次項(xiàng)A2、B2、C2對平均粒徑影響均為極顯著(P<0.01),交互項(xiàng)AB、AC、BC對平均粒徑的影響均為顯著(P<0.05)。三個(gè)單因素對納米乳液液滴的平均粒徑的影響從大到小依次為表面活性劑含量>超聲時(shí)間>超聲功率。由于納米乳液體系是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系,不能夠自發(fā)的形成,液滴的形成必須通過表面活性劑的穩(wěn)定和能量的輸入,當(dāng)超聲空化能達(dá)到足夠促使液滴形成的水平時(shí),表面活性劑的含量是主導(dǎo)體系形成的主要因素。

2.3.2 響應(yīng)面圖分析 響應(yīng)面圖可以直觀的反應(yīng)響應(yīng)值隨因素變化而產(chǎn)生的趨勢,兩兩因素交互作用對響應(yīng)值影響的響應(yīng)面圖如圖5所示。響應(yīng)面圖越陡峭說明兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響越顯著。響應(yīng)面圖中等高線的形狀可以反映出各因素之間的交互作用的強(qiáng)弱,等高線呈橢圓形且較為密集則說明交互作用顯著,等高線呈圓形且較為稀疏則不顯著。由圖5可以看出,在圖5b中表面活性劑濃度和超聲時(shí)間交互作用的等高線呈橢圓形且較為密集,說明這一交互作用顯著,響應(yīng)曲面的走勢相對其他交互作用更為陡峭,說明對響應(yīng)值的影響更為顯著。在圖5a、圖5b中,當(dāng)超聲功率或超聲時(shí)間固定時(shí),平均粒徑隨著表面活性劑濃度的增大而明顯減小,當(dāng)表面活性劑濃度一定時(shí),平均粒徑隨超聲功率和超聲時(shí)間的變化相對較小。圖5c可以看出,超聲功率固定時(shí)的曲線比超聲時(shí)間固定時(shí)的曲線更為陡峭,說明超聲時(shí)間對平均粒徑的影響比超聲功率更大。這一結(jié)論和2.3.1中Z-Ave方差分析得出的結(jié)果相對應(yīng)。

圖5 兩因素交互作用對納米乳液平均粒徑影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of the effect of two-factor interaction on the average particle size of nanoemulsion

2.3.3 回歸模型的優(yōu)化及驗(yàn)證 通過優(yōu)化得出制備含綠茶籽油和分提椰子油納米乳液的最佳工藝條件為:表面活性劑濃度2.2%、超聲功率351 W、超聲時(shí)間12 min,預(yù)測該模型下制備得到的納米乳液的平均粒徑為179 nm。為了驗(yàn)證該響應(yīng)面模型優(yōu)化得到的工藝條件的可靠性,在此工藝條件下進(jìn)行了3組平行驗(yàn)證試驗(yàn),實(shí)際測得納米乳液的平均粒徑為(183.00±1.58) nm,與模型預(yù)測值平均粒徑的相對誤差為2.2%,說明實(shí)際驗(yàn)證值與響應(yīng)面模型的預(yù)測值吻合良好。

2.4 納米乳液穩(wěn)定性研究

2.4.1 pH穩(wěn)定性 由圖6a可知,大豆卵磷脂穩(wěn)定的納米乳液在pH6～8條件下保持相對穩(wěn)定的平均粒徑,但其平均粒徑在pH3～5范圍內(nèi)相對于新制備的納米乳液(pH=6)顯著增加。為了研究pH對納米乳液穩(wěn)定性的影響,同時(shí)測量了納米乳液的Zeta-電位。如圖6b所示,在pH6～8范圍內(nèi),Zeta-電位的絕對值保持在明顯高于30 mV的水平,研究表明,當(dāng)納米乳液Zeta-電位的絕對值高于30 mV時(shí),納米乳液體系的穩(wěn)定性較為理想[24]。結(jié)果表明,在相對高的pH范圍內(nèi)時(shí),所研究的納米乳液能夠保持良好的穩(wěn)定性。這是由于具有高電荷的液滴之間的強(qiáng)靜電排斥作用能夠使液滴保持穩(wěn)定。在pH3～5范圍內(nèi)時(shí),納米乳液Zeta-電位的絕對值明顯低于pH6～8時(shí),其對應(yīng)的平均粒徑也明顯增大。這是因?yàn)榇蠖孤蚜字形膊颗c親水基團(tuán)結(jié)合的磷脂基團(tuán)(如磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酸),這些磷脂基團(tuán)包含的陰離子基團(tuán)的pKa在酸性pH范圍內(nèi)。因此,當(dāng)其處于較低的pH時(shí)可能會失去電荷,從而導(dǎo)致納米乳液的穩(wěn)定性降低,結(jié)果表明該納米乳液體系在pH6～8時(shí)具有良好的穩(wěn)定性。

圖6 pH對納米乳液平均粒徑和Zeta-電位的影響Fig.6 Effect of pH on the average particle size and Zeta-potential of nanoemulsions

2.4.2 熱處理穩(wěn)定性 納米乳液熱處理過程中的平均粒徑和Zeta-電位的變化如圖7所示,大豆卵磷脂穩(wěn)定的納米乳液在熱處理過程中平均粒徑只有略微的增大,并且Zeta-電位保持較高的絕對值,在整個(gè)熱處理溫度范圍內(nèi)都沒有明顯的不穩(wěn)定性。結(jié)果表明,在熱處理過程中,大豆卵磷脂穩(wěn)定的納米乳液的液滴之間仍然可以保持較強(qiáng)的靜電斥力[25],從而具有良好的穩(wěn)定性。

圖7 熱處理對納米乳液平均粒徑的Zeta-電位的影響Fig.7 Effect of heat treatment on Zeta-potential of average particle size of nanoemulsions

2.4.3 離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度對納米乳液的平均粒徑的影響 如圖8a所示,隨著鹽離子的加入,當(dāng)體系的離子強(qiáng)度從0.1 mol/L增加到0.5 mol/L時(shí),平均粒徑顯著增大。圖8b中Zeta-電位的測量結(jié)果顯示,隨著離子強(qiáng)度的提高,納米乳液的Zeta-電位從強(qiáng)負(fù)值(-61.6 mV)變?yōu)槿踟?fù)值(-15 mV)。此時(shí)納米乳液Zeta-電位絕對值的降低歸因于靜電屏蔽效應(yīng)[26],結(jié)果表明,NaCl溶液的加入減少了液滴周圍的電荷量,使維持液滴穩(wěn)定性的靜電排斥作用減弱,導(dǎo)致納米乳液平均粒徑的增大。

圖8 離子強(qiáng)度對納米乳液平均粒徑和Zeta-電位的影響Fig.8 Effect of ionic strength on average particle size and Zeta-potential of nanoemulsions

2.4.4 貯藏穩(wěn)定性 納米乳液在不同溫度下貯藏過程中的平均粒徑和Zeta-電位變化如圖9所示。在5 ℃的貯藏過程中,納米乳液的平均粒徑?jīng)]有發(fā)生明顯的變化,Zeta-電位的絕對值始終保持穩(wěn)定。在27 ℃下貯藏45 d后,納米乳液的平均粒徑僅出現(xiàn)了輕微的增大,Zeta-電位的絕對值減小但始終保持在30 mV以上,可以認(rèn)為納米乳液是穩(wěn)定的。結(jié)果表明在低溫和常溫下貯藏時(shí),所研究的納米乳液體系具有良好的貯藏穩(wěn)定性,這是因?yàn)殡S著液滴尺寸的減小,液滴間的重力分離率降低。研究表明,液滴間的重力分離力通常會導(dǎo)致納米乳液體系的不穩(wěn)定性,而較小尺寸的液滴之間的布朗運(yùn)動可以克服重力分離力[27]。此外,液滴周圍的負(fù)電荷提供了足夠的靜電斥力,抑制了在貯藏過程中液滴的絮凝現(xiàn)象。然而,在50 ℃貯藏期間,與新制備的納米乳液相比,在貯藏30 d后觀察到明顯的相分離和平均粒徑的增加,Zeta-電位的絕對值急劇減小至遠(yuǎn)低于30 mV。據(jù)分析這種現(xiàn)象是長期加熱所致,長期的加熱貯藏會增加納米乳液液滴之間碰撞以及界面性質(zhì)變化的頻率[26],使其更易于破裂,從而導(dǎo)致納米乳液平均粒徑的增大和相分離現(xiàn)象。

圖9 納米乳液在不同溫度貯藏過程中的平均粒徑和Zeta-電位Fig.9 Average particle size and Zeta-potential of nanoemulsions during storage at different temperatures

2.5 體外消化

為了評價(jià)所研究納米乳液體系的體外消化特性,測定和對比了未經(jīng)超聲處理的粗乳液和新制備的納米乳液在模擬小腸消化過程中的FFA釋放率,結(jié)果如圖10所示?？傮w而言,所制備的含綠茶籽油和分提椰子油的納米乳液的FFA釋放率先迅速增加,然后趨于穩(wěn)定。最終的FFA釋放率為87%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于粗乳液的41.8%。研究的納米乳液具有較高的游離脂肪酸釋放率與其較小的平均粒徑有關(guān),油脂在小腸中的分解是一種化學(xué)界面反應(yīng)[28]。液滴的平均粒徑越小,其相應(yīng)的比表面積就越大,油滴和消化體系中脂肪酶的接觸就越充分,因此更易被消化,從而表現(xiàn)出更高的FFA釋放率。此外,研究表明膽固醇酶是一種能夠被膽酸鹽激活的脂肪酶[29],在模擬小腸消化過程中添加的膽酸鹽會激活膽固醇酶,從而催化大豆卵磷脂的消化,這一過程也會釋放出一部分FFA?？傊?所研究的納米乳液體系顯著提高了油相的生物利用率。

圖10 納米乳液和粗乳液的體外消化率Fig.10 In vitro digestibility of nanoemulsions and crude emulsions

3 結(jié)論

超聲制備含綠茶籽油和分提椰子油的納米乳液,通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到制備的最優(yōu)條件為:表面活性劑含量2.2%,超聲功率 351 W,超聲時(shí)間12 min,所得納米乳液的平均粒徑為(183.00±1.58) nm。制備的含綠茶籽油和分提椰子油的納米乳液具有良好的 pH、熱處理、貯藏穩(wěn)定性,但易受離子強(qiáng)度的影響。該納米乳液與粗乳液相比具有更高的游離脂肪酸釋放率,明顯提高綠茶籽油和分提椰子油的生物利用率,是一種極具潛力的以功能油脂和天然表面活性劑構(gòu)建的納米乳液體系,在特醫(yī)食品、飲料、親脂性物質(zhì)輸送載體等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。