裂壺藻突變株S1的細(xì)胞生長(zhǎng)及其油脂合成的超微結(jié)構(gòu)

鄭 操,喻書誠(chéng),陳 濤

(1.湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北孝感 432000;2.中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所,湖北武漢 430071)

二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid,DHA)是一種對(duì)人體具有極高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的多不飽和脂肪酸,對(duì)嬰幼兒的智力發(fā)育和視力形成起著至關(guān)重要的作用[1-2],同時(shí)也可降低人們患心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、哮喘等慢性疾病的概率[3-5]。DHA生物功效的多樣性,使其已成為食品科學(xué)乃至跨學(xué)科領(lǐng)域持續(xù)的研究熱點(diǎn),并且已經(jīng)作為食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑得到廣泛的應(yīng)用[6-8]。

裂壺藻(Schizochytriumsp.)是屬于真菌門、網(wǎng)粘菌綱、破囊壺菌目、破囊壺菌科的一類海洋真菌[9]。其在生長(zhǎng)過程中可在胞內(nèi)積累富含DHA的油脂,由于其具有生長(zhǎng)速度快、易于培養(yǎng)、胞內(nèi)DHA含量高等優(yōu)點(diǎn),并且使用安全、無任何毒副作用,成為商業(yè)化生產(chǎn)DHA的重要藻株之一[10-12]。近年來,人們圍繞裂壺藻中DHA產(chǎn)量的提高開展了大量的研究[13-15]。一方面,從改變裂壺藻自身的遺傳性狀出發(fā),通過物理誘變、化學(xué)誘變等誘變技術(shù)篩選得到高產(chǎn)DHA藻株[10,16-17];另一方面,從改變裂壺藻發(fā)酵培養(yǎng)過程的外部條件出發(fā),通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成[18-20]、改善發(fā)酵培養(yǎng)條件[21-23]等方面提高裂壺藻的DHA產(chǎn)量。

雖然人們?cè)谌绾翁岣吡褖卦逵椭a(chǎn)量和DHA產(chǎn)量等方面進(jìn)行了較為深入的研究[22-23],但這些往往是從宏觀水平反映油脂總量的變化,無法從顯微水平直接分析和比較裂壺藻胞內(nèi)油脂合成的規(guī)律。我們前期以野生型裂壺藻株ATCC20888為出發(fā)藻株,利用低能離子注入誘變技術(shù),篩選獲得一株高產(chǎn)DHA的突變株S1[10]。為從微觀水平上探索該突變株與出發(fā)株ATCC20888在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和胞內(nèi)油脂的形成過程,本實(shí)驗(yàn)將不同培養(yǎng)時(shí)間的藻株細(xì)胞制成超薄切片,通過透射電子顯微鏡觀察、拍片,對(duì)所拍攝的圖片進(jìn)行比較和分析,以期實(shí)現(xiàn)不同藻株中的油脂產(chǎn)量在宏觀和微觀上的統(tǒng)一,為進(jìn)一步誘導(dǎo)突變?cè)孱?、篩選高產(chǎn)DHA微藻提供參考,也為裂壺藻細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過程和油脂合成機(jī)理的研究提供一定指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

裂壺藻野生株ATCC20888 廣東微生物菌種保藏中心提供;裂壺藻突變株S1 本實(shí)驗(yàn)室保藏[10]。

HZ150L恒溫?fù)u床 武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司;H/T12MM離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司;BJ-2CD超凈工作臺(tái) 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;EM UC7切片機(jī) 德國(guó)Leica公司;Tecnai G20 TWIN透射電子顯微鏡 美國(guó)FEI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻株培養(yǎng) 將本實(shí)驗(yàn)室保存的裂壺藻野生株ATCC20888和裂壺藻突變株S1活化后轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基成分為:葡萄糖75 g/L,谷氨酸鈉15 g/L,酵母膏6 g/L,NaCl 2.4 g/L,MgSO46 g/L,以及金屬離子混合液和維生素混合液各2 mL/L[10]。將接種的液體在26～28 ℃,180～200 r/min條件下,連續(xù)培養(yǎng)7 d。其中,裂壺藻突變株S1需收集其培養(yǎng)第1、2、3、4、5、6和7 d的藻體;裂壺藻野生株ATCC20888為對(duì)照藻株,其生長(zhǎng)周期為4 d,收集其培養(yǎng)第1、4和7 d的藻體。

1.2.2 藻體細(xì)胞的收集 達(dá)到上述所需培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)后,取10 mL培養(yǎng)液低速500～1000 r/min離心10 min,除去大分子雜質(zhì),再經(jīng)3500～4000 r/min離心30 min,收集藻體,再將藻體經(jīng)PBS制成懸浮液,4000 r/min離心30 min收集藻體,洗滌2～3次,經(jīng)光學(xué)顯微鏡檢查,樣品純,無雜質(zhì),冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 樣品超薄切片及電子顯微鏡觀察 將上述收集的不同天數(shù)的所有樣品用2.5%戊二醛和1%鋨酸雙固定后,脫水,用丙酮、環(huán)氯樹脂混合液滲透后包埋,在切片機(jī)上完成切片,用鉛-鈉雙染色后干燥,利用透射電子顯微鏡觀察并拍片[24]。

1.2.4 藻體細(xì)胞的測(cè)定及分析 將電子顯微鏡所拍攝的樣品圖片,在電腦中進(jìn)行比對(duì)并測(cè)量,計(jì)算出藻細(xì)胞和油滴的形狀、大小,分析藻體細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和油脂合成過程的變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂壺藻野生株ATCC20888的生長(zhǎng)發(fā)育和油脂合成的過程

裂壺藻野生株ATCC20888生長(zhǎng)第1 d時(shí),初始細(xì)胞呈單個(gè)稍橢圓形;在生長(zhǎng)過程中細(xì)胞逐漸分裂,形成多個(gè)細(xì)胞包含于一個(gè)囊膜中的多個(gè)藻細(xì)胞整體(圖1A);在光學(xué)顯微鏡下也可以看到藻體有裂縫的多個(gè)細(xì)胞,這是裂壺藻的典型特征。第1 d藻體已經(jīng)合成了較小顆粒的油滴(圖1A)。第4 d藻體囊膜溶解,但是也可以明顯看到單個(gè)藻細(xì)胞尚未完成分離(圖1B)。藻體細(xì)胞內(nèi)形成了單個(gè)較大的油滴,油體以透明狀、深色狀和隆脊?fàn)畈⒋?說明胞內(nèi)油脂合成的時(shí)間不同,獲得的油滴狀況也不一樣。第7 d藻體細(xì)胞仍聚集在一起(圖1C)。胞內(nèi)油滴單個(gè)可見,但油脂呈隆脊?fàn)钋翌伾黠@加深。

圖1 裂壺藻野生株ATCC20888細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和油脂合成過程(1700×)Fig.1 The processes of cellular growth and lipid synthesis of Schizochytrium sp.ATCC20888(1700×)注:圖1中A、B、C分別為裂壺藻野生株ATCC20888生長(zhǎng)第1、4、7 d的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖;其中細(xì)箭頭指示囊膜,粗箭頭指示油滴。

從野生型藻株生長(zhǎng)發(fā)育、超微結(jié)構(gòu)中看出,生長(zhǎng)第1、7 d的裂壺藻是囊膜包裹著的多個(gè)細(xì)胞的整體,其表面似裂痕,呈壺狀,這就是裂壺藻得名的主要原因。但隨著生長(zhǎng)至4 d時(shí),包裹著的囊膜自溶游離出單個(gè)的藻細(xì)胞,因而推測(cè)裂壺藻生長(zhǎng)周期約4 d。裂壺藻野生株ATCC20888的胞內(nèi)油脂形成中,生長(zhǎng)第1 d油滴較少而且體積較小(圖1A);生長(zhǎng)第4 d和第7 d時(shí),胞內(nèi)油滴多為單個(gè),無成塊或連成片的狀況出現(xiàn)(圖1B和1C)。

2.2 裂壺藻突變株S1生長(zhǎng)發(fā)育和油脂合成的過程

裂壺藻突變株S1生長(zhǎng)第1 d,可見囊膜內(nèi)存在多個(gè)細(xì)胞,胞內(nèi)有多個(gè)甚至幾十個(gè)油滴,從而使僅一個(gè)囊膜內(nèi)油滴總數(shù)可達(dá)幾十個(gè),但油滴較小,顏色深淺不一(圖2A)。生長(zhǎng)第2 d仍可見囊膜內(nèi)的多個(gè)細(xì)胞,但大部分囊膜已自溶,僅存些許痕跡,胞內(nèi)油滴總數(shù)減少但體積變大,油滴顏色深淺不一(圖2B)。生長(zhǎng)第3 d,雖然仍可見囊膜內(nèi)有多個(gè)細(xì)胞存在,但已經(jīng)出現(xiàn)了囊膜自溶后,細(xì)胞游離成單個(gè)個(gè)體的情況,胞體內(nèi)油滴數(shù)進(jìn)一步減少,油滴體積變大,有的連成塊狀,油滴顏色深淺不一且存在隆脊?fàn)?圖2C)。生長(zhǎng)第4 d,大多數(shù)藻體囊膜自溶,細(xì)胞游離成單個(gè)個(gè)體,胞內(nèi)油脂體積進(jìn)一步變大,連成片狀且可見隆脊?fàn)钣偷?圖2D)。生長(zhǎng)第5 d,絕大多數(shù)藻體囊膜自溶,囊內(nèi)細(xì)胞游離出來,胞內(nèi)油滴多為大塊狀,少數(shù)已連成片狀,其油滴顏色較深且隆脊?fàn)蠲黠@(圖2E)。生長(zhǎng)第6 d藻體大多數(shù)囊膜自溶,細(xì)胞游離出來,胞內(nèi)油滴連成塊狀或片狀,甚至充滿整個(gè)細(xì)胞,可見明顯隆脊?fàn)钣偷?圖2F)。生長(zhǎng)第7 d,藻體囊膜基本自溶,單個(gè)細(xì)胞游離出來,胞內(nèi)油滴連成片狀,多數(shù)細(xì)胞內(nèi)充滿了油脂(圖2G)。

圖2 裂壺藻突變株S1細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和油脂合成過程(1700×)Fig.2 The processes of cellular growth and lipid synthesis of the mutant strain S1 of Schizochytrium sp.(1700×)注:圖2中A～G分別為裂壺藻突變株S1生長(zhǎng)第1、2、3、4、5、6和7 d的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。其中細(xì)箭頭指示囊膜,粗箭頭指示油滴。

可以看出,經(jīng)低能離子注入技術(shù)誘變獲得的突變株S1,其生長(zhǎng)發(fā)育與野生株ATCC20888則完全不同。從生長(zhǎng)第1 d開始直至第7 d結(jié)束都可見單個(gè)藻細(xì)胞生長(zhǎng)。生長(zhǎng)時(shí)間越長(zhǎng),基本上看不到囊膜包裹的多個(gè)藻細(xì)胞整體。這與野生型藻株的細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育有著很大差異,其原因仍待研究。與野生株相比,裂壺藻突變株S1在生長(zhǎng)第1 d就可見一個(gè)細(xì)胞內(nèi)有多個(gè)小油滴存在(圖2A),隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),胞內(nèi)油滴越來越多(圖2C),直至第4 d出現(xiàn)油滴成塊狀現(xiàn)象(圖2D),生長(zhǎng)第5、6和第7 d時(shí),胞內(nèi)油滴明顯變大,連成塊狀或片狀,且基本充滿整個(gè)藻細(xì)胞(圖2E～圖2G)。通過超微結(jié)構(gòu)觀察到突變株胞內(nèi)油脂合成過程,與野生藻株有明顯區(qū)別,從顯微水平上揭示了裂壺藻突變株S1株油脂含量高、DHA產(chǎn)量高的奧秘。

2.3 裂壺藻細(xì)胞大小

在各組照片中選取典型的藻體細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞大小測(cè)量,其結(jié)果見表1。從表1看出,Y1、Y7兩組野生株組細(xì)胞大小與所有突變株組(T1～T7)均有極顯著差別(P<0.01),這兩個(gè)野生株組(Y1、Y7)的藻細(xì)胞極顯著大于突變株組(T1～T7),究其原因是原始藻株囊膜包裹著多個(gè)細(xì)胞,囊膜未自溶,細(xì)胞無法游離,導(dǎo)致體積更大。而突變株組(T1～T7)的藻細(xì)胞從培養(yǎng)第1 d起就有許多單個(gè)游離的藻細(xì)胞,只見少數(shù)囊膜包裹著多個(gè)藻細(xì)胞的藻體。野生株培養(yǎng)生長(zhǎng)第4 d(Y4)時(shí),單個(gè)藻細(xì)胞體積減小,而突變株(T1～T7)在培養(yǎng)過程中細(xì)胞大小基本無顯著差異(P>0.05),只有在第5 d(T5)和第6 d(T6)稍大些,這時(shí),藻細(xì)胞內(nèi)已充滿油脂。

表1 裂壺藻細(xì)胞的大小Table 1 The cell size of Schizochytrium sp.

其中Y1、Y4、Y7分別代表裂壺藻野生株ATCC20888培養(yǎng)第1、4 d和第7 d的樣本;T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7分別代表裂壺藻突變株S1培養(yǎng)第1～7 d的樣本；*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),其余為不顯著；表2同。

表2 裂壺藻胞內(nèi)油滴的大小Table 2 The size of intracellular oil droplets of Schizochytrium sp.

2.4 裂壺藻胞內(nèi)油滴大小

在各組照片中選取典型的藻體細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)油滴大小測(cè)量,其結(jié)果見表2。從表2可以看出,Y4的油滴大小與Y1和Y7均有極顯著差異(P<0.01),Y4油滴較大。這與表1中所述Y1、Y4、Y7組的藻細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育一致,從而可以推測(cè),裂壺藻的生長(zhǎng)周期約為4 d。通過對(duì)比各生長(zhǎng)時(shí)期胞內(nèi)油滴大小及形態(tài),發(fā)現(xiàn)突變株胞內(nèi)油滴隨著發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而變大。尤其是第4 d(T4)后,變大非常明顯,第6 d(T6)達(dá)到最大,這時(shí),藻細(xì)胞內(nèi)基本充滿油滴,且油滴呈塊狀或片狀分布。

2.5 裂壺藻突變株S1胞內(nèi)油脂合成的形態(tài)變化過程

綜上所述,裂壺藻突變株S1胞內(nèi)油脂形成過程可細(xì)分為三個(gè)階段:第一階段,在生長(zhǎng)第1～2 d時(shí),油脂成滴狀,顏色較淺;第二階段,在生長(zhǎng)3～4 d時(shí),油脂連成塊狀,油滴顏色加深,可觀察到呈波浪形的山峰狀油滴,峰脊清晰可見;第三階段,在生長(zhǎng)5～7 d時(shí),油脂形成的峰脊和峰谷非常明顯,其結(jié)果與Ashford等[25]的研究結(jié)果研究基本一致。但他們采用的冷凍蝕刻技術(shù),而本文利用超薄切片技術(shù),看到的胞內(nèi)油滴的超微結(jié)構(gòu)更清晰,峰脊與峰谷清晰可見,這可能就形成了甘油三酯骨架進(jìn)而組成多不飽和脂肪酸和DHA的油滴。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過透射電鏡對(duì)裂壺藻突變株S1和野生株ATCC20888的生長(zhǎng)發(fā)育及胞內(nèi)油脂形成過程進(jìn)行了對(duì)比分析。結(jié)果表明突變株生長(zhǎng)發(fā)育速度、胞內(nèi)油脂合成速度以及油脂含量均優(yōu)于野生株,并初步闡釋了突變株S1油脂含量高、DHA產(chǎn)量高的奧秘,從微觀水平上探索細(xì)胞發(fā)育和油脂形成過程提供了研究思路,為今后藻類誘導(dǎo)突變、藻株篩選及突變株性能鑒定提供了參考。