傳統(tǒng)藏式牦牛酸奶中優(yōu)良乳酸菌篩選與產(chǎn)香性能分析

梁明明,曹菲薇,楊歡東,于 靚,鄭志瑤,梁竟一,王偉軍,陳 波,劉建新,任大喜,*

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,奶業(yè)科學(xué)研究所,浙江杭州 310058;2.浙江一鳴食品股份有限公司,浙江溫州 325000)

乳酸菌是一類具有多種益生功能的微生物,因其良好的發(fā)酵特性,目前廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品中[1]。乳酸菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一系列的酶,分解乳中的糖、蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì),生成可揮發(fā)性化合物來影響或改變產(chǎn)品的香氣。酸奶中的香味物質(zhì)有多種,其中雙乙酰是酸奶最重要的特征風(fēng)味物質(zhì)之一,具有奶油香味,常被用于評價酸奶香氣品質(zhì)[2-4]。乙醛是另一種重要的風(fēng)味物質(zhì),產(chǎn)品中乙醛能賦予酸奶青蘋果和堅果的風(fēng)味[5]。此外,2-丙酮和2-丁酮也是衡量酸奶品質(zhì)的兩種重要化合物,能賦予酸奶特殊的甜香和果香味。

西藏、川西等高原牧區(qū)牦牛奶資源豐富,當(dāng)?shù)啬撩袷来赜脗鹘y(tǒng)而古老的自然發(fā)酵方法制作的藏式酸奶組織細膩、風(fēng)味獨特[6]。當(dāng)?shù)仃笈０l(fā)酵乳中蘊含有遺傳穩(wěn)定性好、抗逆性強、性能優(yōu)良的乳酸菌[7-10]。國內(nèi)部分研究學(xué)者對我國不同地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品進行了篩選工作[11-13],邵建寧等[14]從甘南牧區(qū)、河西牧區(qū)采集的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選出96株乳酸菌,經(jīng)發(fā)酵性能評價最終篩選出6株優(yōu)良乳酸菌。秦虹等[9]從甘肅部分藏區(qū)采集的自然發(fā)酵牦牛乳中分離出195株乳酸菌,經(jīng)過發(fā)酵性能和產(chǎn)香能力評估,最終選出5株性能優(yōu)良的乳酸菌。張和平[15]從中國西部及蒙古國的951份自然發(fā)酵乳制品中分離鑒定出3388株乳酸菌,建立中國首個原創(chuàng)性乳酸菌菌種資源,并從中篩選出一株性能優(yōu)良的乳酸菌(L.caseiZhang)，且已將其投入到了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中。

雖然國內(nèi)學(xué)者在乳酸菌的篩選等方面已有研究,但目前可以投入商業(yè)化應(yīng)用的乳酸菌仍然較少。因此,本研究旨在從藏式傳統(tǒng)牦牛酸乳中分離鑒定乳酸菌,并結(jié)合發(fā)酵性能和產(chǎn)香性能等進行篩選,期望從中篩選到性能優(yōu)良的菌株用于工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛酸乳 采自于四川阿壩藏族羌族自治州阿壩縣、紅原縣、諾爾蓋縣等地的游牧牧民家中,傳統(tǒng)手工發(fā)酵,共計26份;嗜熱鏈球菌903(發(fā)酵劑) 分離自科漢森公司;4-甲基-2-戊酮 色譜純,美國Sigma-Aldrich公司;無抗脫脂奶粉 新西蘭恒天然有限公司;MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;生牛乳 浙江一鳴股份食品有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒 生工生物工程(上海)有限公司。

ECLIPSE E100光學(xué)顯微鏡 日本Nikon公司;FE28數(shù)顯pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;固相微萃取頭DVB/CAR/PDMS(50/30 μm) 美國Sigma-Supelco公司;7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫有限公司;DW-HW258超低溫冰箱 中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離純化 取10 mL樣品于90 mL生理鹽水中進行梯度稀釋,取0.1 mL合適稀釋度的樣品稀釋液,涂布于MRS(用于分離桿菌)或M17(用于分離球菌)固體培養(yǎng)基上,置于37 ℃培養(yǎng)48 h。觀察菌落生長情況,挑取具有乳酸菌典型特征的單個菌落,在分離培養(yǎng)基上反復(fù)劃線培養(yǎng)直至電子顯微鏡鏡檢為純菌株。進行革蘭氏染色和H2O2酶實驗,選擇革蘭氏陽性、H2O2酶陰性的菌株,接種于MRS、M17液體培養(yǎng)基中,在37 ℃培養(yǎng)18 h后,置于40%(V/V)的甘油管中-80 ℃冷凍保藏。科漢森商業(yè)發(fā)酵劑中的菌株也采用上述M17培養(yǎng)基進行分離,經(jīng)過純化和鏡檢后作為本研究的對照菌株(903)。

1.2.2 菌株的初篩

1.2.2.1 遺傳穩(wěn)定性分析 將經(jīng)過16S rDNA鑒定后確認為基礎(chǔ)乳酸菌的菌株活化,按接種量2%(V/V)比例接種到10 mL 12%(w/V)的滅菌脫脂乳中,在37 ℃條件下發(fā)酵,以肉眼觀察脫脂乳培養(yǎng)基變黏稠,呈凝膠狀,試管倒置不呈流動液體時,則視為可以凝乳。置于4 ℃冷藏24 h,記錄凝乳時間,觀察色澤、組織狀態(tài)、乳清析出等。如此連續(xù)傳代20次,選擇連續(xù)傳代可以凝乳且狀態(tài)穩(wěn)定的菌株進行下一步篩選。

1.2.2.2 滴定酸度測定 根據(jù)GB/T 5009.239-2016 《食品酸度的測定》[16]的方法進行滴定酸度測定,以重復(fù)性條件下獲得的三次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示。

1.2.2.3 凝乳時間測定 將遺傳表現(xiàn)穩(wěn)定的菌株以接種量2%(V/V)比例接種到250 mL 12%(w/V)滅菌脫脂乳中,在37 ℃條件下培養(yǎng)。按1.2.2.2滴定酸度的測定方法進行酸度測定,根據(jù)GB/T 19302-2010《發(fā)酵乳》[17]中對酸乳酸度的要求,以酸度>70 °T為發(fā)酵終點,測定發(fā)酵時間。

1.2.2.4 感官評價 根據(jù)國標(biāo)GB 19302-2010《發(fā)酵乳》[17]中對發(fā)酵乳的感官要求進行感官評價,按表1進行評價分數(shù)計算。由10位食品相關(guān)的專業(yè)人員分別對冷藏24 h后的發(fā)酵乳進行感官評價,包括:色澤評定:將適量酸乳放入燒杯中,在日光燈下觀察其色澤；滋味和氣味評定:打開封蓋后馬上聞氣味,然后用溫水漱口,再品嘗滋味；組織狀態(tài)評定:將酸乳傾斜倒在光滑的黑瓷板上,略微傾斜轉(zhuǎn)動,仔細觀察組織狀態(tài)。感官評價總分100分,其中色澤10分,滋味和氣味40分,組織狀態(tài)50分。

表1 發(fā)酵乳感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standards for sensory evaluation of fermented milk

1.2.3 菌株的鑒定 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取乳酸菌的總基因組,以其為模板進行PCR擴增。采用細菌通用PCR擴增引物:正向引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′);反向引物1541r(5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′)。PCR擴增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,如此進行30次循環(huán);72 ℃延伸10 min后,PCR儀降至12 ℃進入保溫程序。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢驗合格后送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序。將所得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行同源性比較分析,下載與目標(biāo)菌株序列同源性相近的菌株序列,利用MEGA-X 軟件NJ(neighbor joining)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(自展數(shù):1000),以鑒定每個菌株的種類。

1.2.4 菌株產(chǎn)香能力分析 樣品制備:將篩選到的菌株,按2%(V/V)比例接種到滅菌生牛乳中。置于37 ℃條件下進行發(fā)酵,凝乳后的酸奶置于4 ℃冰箱,后熟24 h后用于風(fēng)味分析。分析采用固相微萃取頂空法與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(SPME-GC-MS)按照文獻[18]方法測定樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),以此衡量菌株代謝產(chǎn)香的能力。

樣品的前處理:取約100 g酸奶樣品于250 mL固相微萃取瓶內(nèi),加入50 mL超純水,同時加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液(4-甲基-2-戊酮,50 mg/kg)。樣品置于55 ℃水浴中磁力攪拌平衡30 min,采用固相微萃取吸附45 min后進樣。

氣相色譜條件:色譜柱采用為DB-WAX柱(柱長60 m,內(nèi)徑0.25 mm,液膜厚度0.5 μm)。采用程序升溫條件,起始柱溫為35 ℃,并保持1 min,然后以3 ℃/min升溫至220 ℃,保持10 min,20 ℃/min升溫至240 ℃,保持5 min。載氣為高純He(99.999%),流速1.0 mL/min,采用不分流操作。質(zhì)譜條件:電離方式EI,電子能量為70 eV,接口溫度、四級桿溫度、離子源溫度分別為240、150、230 ℃。掃描質(zhì)量范圍為m/z 33～500。

未知化合物經(jīng)計算機與質(zhì)譜圖庫相匹配,報告選擇匹配度大于80%的鑒定結(jié)果。風(fēng)味物質(zhì)的定量分析由內(nèi)標(biāo)法確定(內(nèi)標(biāo)為4-甲基-2-戊酮),即采用各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積對比進行半定量分析,計算公式如下,

揮發(fā)性物質(zhì)濃度(μg/L)=(各成分峰面積×內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量)/(內(nèi)標(biāo)物峰面積×樣品量)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有試驗重復(fù)3次及以上,文中數(shù)據(jù)采用均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析進行比較,依據(jù)Turkey進行顯著性分析,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初步篩選結(jié)果

26份酸奶樣品中共分離純化得到114株純菌株,遺傳穩(wěn)定性測定篩選出36株可以凝乳且凝乳狀態(tài)穩(wěn)定的乳酸菌用于后續(xù)發(fā)酵性能篩選。

將上述遺傳穩(wěn)定的基礎(chǔ)菌株在發(fā)酵乳中培養(yǎng),通過測定其發(fā)酵時間及感官評價,初步篩選出5株乳酸菌(AB0101、AB0801、AB1504、AB2302、AB2402),結(jié)果如表2所示,5株單菌株在37 ℃下發(fā)酵12%(w/V)的脫脂乳時,凝乳時間為4.5～7.5 h,發(fā)酵終點的滴定酸度為74.0～78.4 °T,符合國標(biāo)對發(fā)酵乳產(chǎn)品要求(>70 °T)[17];各菌株感官表現(xiàn)良好,評分在79.6～86.3之間。其中菌株AB0101的凝乳時間與滴定酸度,AB1504的滴定酸度和感官評價均與商業(yè)菌株903無顯著差異,表現(xiàn)優(yōu)良。與本研究結(jié)果類似,邵建寧等[14]從甘肅牧區(qū)采集的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選出6株發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌,在37 ℃下發(fā)酵牛乳,凝乳時間在6.5 h以內(nèi),發(fā)酵乳酸度>70 °T,組織狀態(tài)較好,凝乳完整。由此可見,本試驗篩選的五株乳酸菌遺傳穩(wěn)定、發(fā)酵時間短、感官評分高,發(fā)酵性能優(yōu)良,可用于后續(xù)研究。

表2 5株乳酸菌初篩試驗結(jié)果Table 2 Results of primary screening of 5 LAB strains

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

五株初篩菌株的菌落形態(tài)、細菌形態(tài)和16S rDNA的PCR擴增片段電泳圖等見圖1和圖2。系統(tǒng)發(fā)育樹分析圖如圖3所示。可知,菌株AB0101、AB0801、AB2402的菌落形狀不規(guī)則,邊緣嚙齒狀,表面光滑,有光澤,易挑起,革蘭氏染色均為陽性,符合乳桿菌的形態(tài)學(xué)特征。16S rDNA的測序結(jié)果顯示與德氏乳桿菌保加利亞亞種(Sequence ID:HM058208.1)的相似度最高,相似度均>99%,判斷為德氏乳桿菌保加利亞亞種。其中AB0101、AB0801菌落扁平,且呈半透明或透明狀;而AB2402菌落隆起,乳白色,不透明,革蘭氏染色均為陽性,符合乳球菌的形態(tài)學(xué)特征。16S rDNA的測序結(jié)果顯示AB1504和AB2302與嗜熱鏈球菌(Sequence ID:EF990662.1、Sequence ID:MN447108.1)的相似度最高,相似度均為100%,因此判斷菌株AB1504、AB2302均為嗜熱鏈球菌。

圖1 5株菌的菌落形態(tài)和顯微鏡圖Fig.1 Colony diagram and microscopic diagram of 5 strains

圖2 菌株16S rDNA的PCR擴增片段電泳圖Fig.2 PCR fragment of 16S rDNA of strain注:電泳圖從左到右分別是M:Marker;A:AB0101;B:AB0801;C:AB2402;D:AB1504;E:AB2302。

圖3 5株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of 5 LAB strains注:采用鄰接(Neighbor-Joining)法和 p距離公式進行系統(tǒng)發(fā)育分析,括號內(nèi)為GenBank收錄號, 每個分支點處的數(shù)字為Bootstrap(l000次抽樣)的支持百分率,標(biāo)尺代表0.1%的序列差異度。

2.3 菌株產(chǎn)香能力分析

本研究采用固相微萃取-頂空氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法對初篩得到的5株乳酸菌進行發(fā)酵乳的香味物質(zhì)進行分析,菌株AB1504發(fā)酵乳色譜圖如圖4所示。共檢測出40多種揮發(fā)性物質(zhì),主要有有機酸類、醛類、酮類、醇類、酯類、芳香烴和含硫化合物等組分,五株單菌株發(fā)酵乳與商業(yè)菌劑903發(fā)酵乳的風(fēng)味物質(zhì)含量結(jié)果如表4所示。

表3 菌株發(fā)酵乳中的風(fēng)味物質(zhì)濃度(mg/L)Table 3 Aroma compounds in fermented cow milk produced by pure cultures(mg/L)

圖4 菌株AB1504發(fā)酵乳的色譜圖 Fig.4 Chromatogram of fermented milk of strain AB1504

目前認為酸奶中重要的香味物質(zhì)主要包括乙醛、雙乙酰、乙偶姻、丙酮及丁酮等香味物質(zhì)。五株菌株發(fā)酵乳與商業(yè)菌劑發(fā)酵乳中,只有菌株AB1504和商業(yè)菌劑903的發(fā)酵乳中檢測出雙乙酰,含量分別為4.90、2.90 mg/L。田懷香等[19]從西藏靈菇中篩選高產(chǎn)雙乙酰的乳酸菌,產(chǎn)雙乙酰的能力為11.13 mg/L,彭濤等[25]從新疆的自制酸奶篩選到一株高產(chǎn)雙乙酰的戊糖乳桿菌。本研究中菌株AB1504與商業(yè)菌劑903中也均有較高的乙偶姻。乙偶姻與雙乙酰相似,但乙偶姻的風(fēng)味明顯弱于雙乙酰,雙乙酰乙酰基通過還原酶可以轉(zhuǎn)化為乙偶姻,這有助于減弱酸奶中的刺激風(fēng)味[20]。乙醛也是酸奶中重要的風(fēng)味物質(zhì),酸奶中乙醛主要由蘇氨酸代謝產(chǎn)生[21],能夠賦予酸奶新鮮的青蘋果或堅果風(fēng)味[5]。商業(yè)菌劑903發(fā)酵乳檢測出的乙醛含量最高(1.7 mg/L),其次是菌株AB1504發(fā)酵乳(1.13 mg/L),其他菌株發(fā)酵乳含量較低。丙酮和丁酮也是衡量酸奶制品風(fēng)味的兩種重要化合物。丙酮具有甜香和果香,可賦予酸奶特殊風(fēng)味,酸奶中的丙酮一部分來自牛乳本身,另外一部分則由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生[22]。根據(jù)前人的研究報道典型酸奶中丙酮的濃度為0.3～4.0 mg/L[23],本試驗中,五株單菌株發(fā)酵乳中檢測到的丙酮含量均在此范圍內(nèi),而商業(yè)菌劑903的發(fā)酵乳中丙酮含量為4.35 mg/L。丁酮也可賦予酸奶特殊的香味,通常酸奶中丁酮的含量要低于丙酮,本試驗中檢測到的丁酮含量均低于丙酮。此外,發(fā)酵產(chǎn)生的酸類中乙酸也有一定的香味[24],研究表明乙酸在酸奶中含量在0.5～18.8 mg/L 時最佳[19],酸奶中乙酸含量過高則會產(chǎn)生醋味,不容易被消費者接受[5]。本研究中五株菌株產(chǎn)生的乙酸含量濃度均在1 mg/L左右,商業(yè)菌劑903發(fā)酵乳中乙酸含量較高(14.3 mg/L)。本研究酸奶的風(fēng)味物質(zhì)還包括醇類、酯類和硫化物等,菌株不同含量也有各有差異。綜上所述,嗜熱鏈球菌AB1504發(fā)酵乳產(chǎn)生香味成分含量豐富,雙乙酰、乙醛、乙偶姻、丙酮及丁酮等酸奶關(guān)鍵香味物質(zhì)濃度接近或高于商業(yè)菌株,具有商業(yè)開發(fā)應(yīng)用的潛力。

3 結(jié)論

從四川阿壩藏區(qū)羌族自治州地區(qū)采集的26份傳統(tǒng)藏式牦牛酸奶中分離到114株菌株。經(jīng)遺傳穩(wěn)定性、凝乳時間及感官評價等初篩方法篩選出5株發(fā)酵性能較優(yōu)良的菌株,其凝乳時間為4.5～7.5 h;滴定酸度為74.0～78.4 °T,感官評分為79.6～86.3。其中菌株AB0101和AB1504在發(fā)酵性能上與商業(yè)菌株接近。通過頂空氣質(zhì)測定發(fā)酵乳的風(fēng)味物質(zhì),發(fā)現(xiàn)菌株AB1504發(fā)酵產(chǎn)生的乙醛、雙乙酰等關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的含量顯著高于其他菌株,且接近于商業(yè)發(fā)酵劑,經(jīng)鑒定菌株AB1504為嗜熱鏈球菌。上述研究結(jié)果表明嗜熱鏈球菌AB1504具有良好的發(fā)酵性能和產(chǎn)香能力,具有商業(yè)應(yīng)用的潛力。