清香酒醅中高產細菌素乳酸菌的篩選及其細菌素特性研究

王萌萌,史 瑛,李智琪,毛 健,張秀紅

(1.山西師范大學生命科學學院,山西臨汾 041004;2.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室,江蘇無錫 214122;3.山西師范大學食品科學學院,山西臨汾 041004)

中國白酒的工藝特點是制曲釀酒。大曲的制備采用生料制曲、自然接種、開放培養的生產方式,整個釀酒過程處于開放環境中,白酒釀造涉及到的微生物非常復雜,主要包括酵母菌、細菌、霉菌、放線菌等[1-2]。清香型白酒主要采用地缸發酵的方式生產,厭氧環境下存活的微生物主要包括酵母菌和乳酸菌。乳酸菌通過發酵代謝產生乳酸,進而與乙醇酯化產生白酒香氣成分乳酸乙酯,促進酒體的形成,尤其在清香白酒中,主體香氣成分就是乙酸乙酯和乳酸乙酯,因此乳酸菌在清香白酒釀造中具有重要作用。但是在每年春末夏初,隨著氣溫的升高,釀酒環境中的乳酸菌開始大量繁殖,導致酒醅中乳酸菌大幅增加,使一部分高粱淀粉降解的還原糖轉化為乳酸,從而降低產酒量。同時乳酸過量會產生大量乳酸乙酯,而改變酒體香氣成分比例,降低基酒質量[3-4]。目前各個酒企普遍缺乏夏季有效控制乳酸菌數量的手段和方法,因此在夏季來臨前選擇停產。事實上在停產前,基酒的產量和質量也會受到一定的影響。

乳酸菌是白酒釀造中重要的功能微生物,而乳酸菌在釀酒環境中的數量是控制基酒品質和質量的重要條件。細菌素是乳酸菌產生的一類競爭性抑制親緣關系較近的天然蛋白質或肽類物質[5],且在食品領域有廣泛的應用[6]。Mora等[7]在研究中發現乳酸菌產生的細菌素能夠有效促進近緣菌株自溶。因此可以用作控制乳酸菌數量的方法和策略。目前關于酒醅乳酸菌細菌素的研究尚未見報道。本研究從清香型白酒酒醅中篩選出產細菌素的乳酸菌,分析其細菌素特性以及對釀酒微生物的影響,為夏季酒醅控酸開辟新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清香型酒醅 山西省杏花村汾酒廠股份有限公司提供;釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)J2-1、J7-2、J10-1、J12-1、Q4-5、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientails)Q3-1 分離自汾酒大曲及酒醅,保存于山西師范大學汾酒釀造過程研究中心;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 由山西師范大學汾酒釀造過程研究中心提供;胰蛋白酶(≥2500 U/mg)、木瓜蛋白酶(≥2000 U/mg) 阿拉丁試劑公司;蛋白酶K(≥40 U/mg)、胃蛋白酶(≥2500 U/mg) 上海生工;其余藥品 均為國產分析純。

Thermo 905/490 L-80 ℃超低溫冰箱 賽默飛世而科技(中國)有限公司;DYY-6C型電泳儀 六一儀器廠;Gel Doc XR+凝膠成像儀 Bio-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 清香酒醅中乳酸菌的分離 無菌條件下將清香酒醅稀釋至10-5、10-6、10-7后,分別取200 μL稀釋液于MRS固體培養基中。將符合乳酸菌形態的單菌落進行革蘭氏染色和觸酶試驗[8-9]。

1.2.2 產細菌素乳酸菌的初篩 將分離純化后的乳酸菌菌株在MRS液體培養24 h后,離心(12000 g、10 min)過濾,得到無細胞發酵上清液[10-12]。以金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)為指示菌,以楊尚嬌等[13]的方法篩選產細菌素乳酸菌。

1.2.3 乳酸菌產細菌素的特性

1.2.3.1 酸性物質和過氧化氫試驗 將液體培養基的pH分別用1.0 mol/L乳酸、乙酸進行調節,使其與菌株發酵上清液的pH相同[14-15]。同時,調節發酵上清液的pH至7.0,保持過氧化氫酶濃度在1.0 mg/mL,37 ℃溫浴2 h后,調回初始值[16-17]。S.aureus為指示菌,以楊尚嬌等[13]方法檢測抑菌物質。

1.2.3.2 蛋白酶敏感性試驗 使用木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶檢測蛋白酶敏感性,S.aureus為指示菌,參照1.2.3.1的方法檢蛋白酶敏感性[15-17]。

1.2.4 產細菌素乳酸菌的鑒定 用CTAB法[18]提取乳酸菌DNA作為模板,細菌通用引物1492R和27F PCR擴增16S rDNA片段,送生工(上海)公司進行測序。測序結果通過MEGA 6.0進行統計和聚類分析,構建進化樹。

1.2.5 乳酸菌的生長及其細菌素的抑菌活性 將乳酸菌按3%接種量接種于液體培養基中,每隔2 h測OD600值。同時,每4 h制備一次發酵上清液,S.aureus為指示菌,檢測抑菌直徑[19]。具體方法參照1.2.2。

1.2.6 乳酸菌細菌素理化性質探究 將乳酸菌細菌素應用的首要條件是,乳酸菌細菌素能夠在釀酒環境中保持活性,因此需要進一步探究乳酸菌細菌素的穩定性。

1.2.6.1 乳酸菌細菌素穩定性探究 取4、30、60、90、121 ℃探究乳酸菌細菌素溫度耐受性;將發酵上清液的pH調整至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0,測定乳酸菌細菌素pH耐受性[20-22]。S.aureus為指示菌,參照楊尚嬌等[13]方法檢測。

1.2.6.2 乳酸菌細菌素對釀酒微生物的影響 選取酒醅中微生物酵母菌為指示菌,檢測乳酸菌細菌素對酒醅中主要釀酒微生物的影響,參照楊尚嬌等[13]方法檢測。

1.3 數據處理

上述實驗結果均重復三次,采用Graphd 6.0、SPSS 24.0等對實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離及篩選

將清香酒醅來源的菌懸液涂布在MRS固體培養基培養并進行劃線分離,菌株YP36在37 ℃下培養48 h后,生長狀況如圖1所示:YP36菌落呈圓形、表面凸起、濕潤、邊緣整齊,形態為桿狀,無鞭毛,符合乳酸菌形態特征。

圖1 菌株YP36菌落及菌體形態Fig.1 Colony and morphology of strain YP36注:A:乳酸菌菌落形態;B:10×100顯微鏡形態示意圖。

直徑為0.8～2.0 mm、白色或微白色、具有光澤的圓形單菌落,且革蘭氏染色陽性,觸酶陰性的菌株初步認為乳酸菌。共篩選出符合乳酸菌形態及生理特征的菌株146株。

對146株菌株進行細菌素檢測,有10株菌能同時抑制S.aureus、E.coli、B.subtilis,結果見表1。其中YP36上清液對3種指示菌的抑菌直徑均大于15 mm,對S.aureus的抑菌直徑達19.50 mm,抑制能力最強,其抑制作用見圖2。其余抑菌效果好的菌株有MC15-1、SL28和MC49-1,因此,選取這4株菌進行后面的研究。

表1 乳酸菌細菌素對指示菌的抑制作用Table 1 Antibacterial effects of lactic acid bacteria bacteriocin on indicator bacterial

圖2 乳酸菌YP36細菌素對指示菌的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of lactic acid bacteria YP36 bacteriocin on indicator bacteria注:A:金黃色葡萄球菌;B:大腸桿菌;C:枯草芽孢桿菌。

2.2 乳酸菌產細菌素的特性

2.2.1 酸性物質和過氧化氫試驗 Vázquez等[23]認為乳酸菌在生長時抑制其他菌株的生長的主要原因在于:乳酸菌能夠產生酸、過氧化氫及細菌素等物質。

在排除乳酸、乙酸和過氧化氫試驗中,無菌MRS液體培養基經乳酸、乙酸調至4株菌株發酵24 h后的pH后,以S.aureus為指示菌做抑菌試驗,結果抑菌圈都為零,表明沒有抑菌作用;YP36、MC15-1、SL28、MC49-1的發酵液經過氧化氫酶處理后進行抑菌試驗,結果見表2。從表2可以看出,4株菌的發酵上清液經過氧化氫酶處理后均能夠抑制乳酸菌的生長,抑菌直徑與未處理的菌株發酵液相比,略有下降但不顯著(P>0.05),表明過氧化氫不是主要的抑菌物質。

表2 過氧化氫酶處理對乳酸菌菌株抑菌活性的影響Table 2 Effect of catalase treatment on antibacterial activity of LAB strains

2.2.2 蛋白酶敏感性試驗 上述4株乳酸菌發酵上清液經不同類型的蛋白酶處理后,試驗結果如圖3所示。與對照組相比,YP36發酵上清液經蛋白酶K、胃蛋白酶處理后,抑菌直徑顯著降低(P<0.05),表明YP36發酵上清液中抑菌物質對蛋白酶K、胃蛋白酶敏感;MC15-1發酵上清液經木瓜蛋白酶、胃蛋白酶處理后,抑菌直徑顯著降低(P<0.05);SL28抑菌物質對蛋白酶K和胰蛋白酶敏感(P<0.05);MC49-1對胰蛋白酶敏感(P<0.05)。乳酸菌發酵上清液經蛋白酶處理后,抑菌直徑顯著降低。試驗結果表明發酵上清液中存在一種能夠被蛋白酶分解的抑菌物質,初步判斷抑菌物質具有蛋白質屬性。

圖3 蛋白酶處理對乳酸菌抑菌活性的影響Fig.3 Effect of protease treatment on antibacterial activity of LAB strains注:A:YP36;B:MC15-1;C:SL28;D:MC49-1；不同小寫字母代表差異顯著；圖5同。

2.3 產細菌素乳酸菌的鑒定

對篩選到的4株抑菌活性高的乳酸菌提取其基因組DNA,PCR擴增16S rDNA后測序,測序結果在GenBank中進行同源性分析,并構建系統發育進化樹。結果如圖4所示,與YP36親緣關系最近的是植物乳桿菌(LactobacilluplantarumMT231813.1);與MC15-1、MC49-1親緣關系最近的是短乳桿菌(LactobacillusbrevisAB362619.1)和(LactobacillusbrevisFJ476121.1);與SL28親緣關系最近的是布氏乳桿菌(LactobacillusbuchneriAB300611.1)。

圖4 系統發育樹的構建Fig.4 Phylogenetic relationships of four lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌生長曲線及其細菌素的抑菌活性

根據乳酸菌生長曲線及其細菌素的抑菌活性來掌握乳酸菌的生長情況與細菌素產量的關系,結果表明:乳酸菌在生長遲緩期時,對指示菌無抑制作用,當乳酸菌進入穩定期時,對指示菌的抑制作用逐漸趨于穩定。結果如圖5所示:YP36在10 h進入穩定期,此時發酵上清液的抑菌直徑呈上升趨勢,在第20 h抑菌直徑達到最大;MC15-1在16 h進入穩定期,而發酵上清液的抑菌直徑在20 h達到最大;SL28菌株的生長量與抑菌物質呈同步增長態勢,在菌株到達穩定期16 h時,抑菌直徑達到最大;MC49-1在12 h進入穩定期,在16 h時抑菌直徑最大。因此,綜合考慮,選取20 h觀察抑菌直徑。

圖5 乳酸菌生長曲線及其細菌素的抑菌活性Fig.5 The growth curve of lactic acid bacteria and the bacteriostasis activity of their barteriocin

2.5 乳酸菌細菌素穩定性試驗

2.5.1 乳酸菌細菌素熱穩定性試驗 為了考察酒醅乳酸菌細菌素的熱穩定性,將4株菌的細菌素分別在不同溫度下處理30 min后進行抑菌活性測定,結果如圖6所示,隨著熱處理溫度的升高,YP36及SL28抑菌活性無顯著變化(P>0.05)。MC15-1和MC49-1在4～60 ℃條件下抑菌直徑無顯著變化(P>0.05),在60～121 ℃時,抑菌直徑隨著溫度的升高有所降低,當溫度在121 ℃時,仍有抑菌活性,分別是4 ℃下的抑菌活性的68.4%和56.38%。試驗表明,四株菌的抑菌物質均具有一定的耐熱性。

圖6 溫度對乳酸菌細菌素抑菌活性的影響Fig.6 Effect of temperature on the bacteriestasis activity of LAB barteriocin

2.5.2 乳酸菌細菌素pH穩定性 為了考察酒醅乳酸菌細菌素的pH穩定性,將4株菌的發酵上清液調整到不同的pH后進行抑菌活性測定,結果如圖7所示。從圖7可以看出:4株菌的酸堿穩定性變化趨勢非常相似,pH在2.0～4.0范圍內,抑菌活性均無顯著變化(P>0.05);pH在4.0～6.0時,抑菌活性略有下降;在pH達8.0時4株菌的抑菌活性均消失。試驗結果表明:4種乳酸菌細菌素在酸性環境下活性較高。

圖7 pH對乳酸菌細菌素抑菌活性的影響Fig.7 Effect of pH on the bacteviestasis activity of LAB barteriocin

2.5.3 乳酸菌細菌素對釀酒微生物的影響 為了考察乳酸菌細菌素對釀酒功能菌的影響,選取清香型釀酒環境中主要微生物S.cerevisiae、I.orientails作為指示菌進行抑菌試驗。結果如表3所示:酒醅乳酸菌細菌素對所有實驗的酵母菌無抑制作用。

表3 乳酸菌細菌素對釀酒微生物的影響Table 3 Effects of lactic acid bacteria bacteriocin on brewing microorganisms

3 結論

本研究利用牛津杯法從清香酒醅中分離得到10株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌活性的乳酸菌。用16S rDNA序列分析對金黃色葡萄球菌抑制最強的4株乳酸菌YP36、MC15-1、SL28、MC49-1。進一步對這4株菌的抑菌物質進行研究,排除乳酸、乙酸和過氧化氫后仍有抑菌活性,個別蛋白酶處理后抑菌活性會下降,表明抑菌物質是蛋白質或多肽。在pH穩定性實驗中,4株菌抑菌物質都在酸性條件下抑菌活性較強，都具有一定的熱穩定性。4株菌的細菌素對篩選酒醅來源酵母菌無抑制作用。