微生物合成納米硒的研究進展

楊 輝1,王麗紅1,孔 陽1,蘇 文1,賀 博

(1.陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西西安710021;2.安康市富硒產品研發中心，農業農村部富硒產品開發與質量控制重點實驗室,陜西安康 725000)

研究發現[10-12],當單質硒處于納米級(Se-NPs)時,具有特殊的理化性質,活性強、毒性低、吸收好,安全使用量高于無機硒和有機硒,是一種新型的補硒形態,具有良好的應用前景。本文綜述了Se-NPs的特點,微生物合成Se-NPs的優勢及微生物種類,并歸納了Se-NPs功能性產品開發的研究進展。

1 納米硒的特點

納米硒在結構和性質上具有獨特的性質受到研究人員的廣泛關注,主要特點如下:

1.1 納米硒是紅色單質硒,生理活性強

在未發現納米硒以前,單質硒只有灰色、黑色之分,無生物活性,不能被生物體利用。我國研究者張勁松等[13-14]首次以VC為還原劑合成出了紅色的納米級單質硒,已證明紅色納米硒具有抗癌、抗菌、抗氧化、免疫調節等生理活性[15]。

1.2 納米硒生物活性與粒徑密切相關

研究表明[16-17]粒徑在 5～200 nm之間的納米硒才具有明顯的生物學效應。Wang等[18]對比了35和91 nm兩種粒徑的SeNPs對癌細胞的抑制作用,Jia等[19]制備并比較粒徑為 28、33、44、52 nm的SeNPs對宮頸癌HeLa細胞的抑制作用,結果均表明SeNPs抑制腫瘤細胞的增殖能力和粒徑大小成反向關系,即粒徑越小抑制癌細胞增殖能力越強。在體外抗氧化、小鼠肝損傷及糖尿病治療方面,不同尺寸納米硒的效果差異明顯,趙勝男[20]對比60、80、100 nm納米硒的作用,同樣說明SeNPs粒徑越小療效越好。

1.3 蛋白質可增強納米硒穩定性

納米級的單質硒不穩定,具有較高的表面自由能,容易團聚,或轉變成無活性的灰色或黑色單質硒,蛋白質可增強納米硒的穩定性[21]。Sarkar等[22]利用一株鏈格孢菌Alternariaalternate的培養基濾液還原Se(VI)合成SeNPs,發現SeNPs得以穩定存在是因為表面包裹的蛋白質的保護作用。Dobias等[23]在大腸桿菌發酵液中分離出了結合在納米硒上的蛋白質AdhP、Idh、OmpC及AceA,研究表明[24]蛋白質可為SeNPs的合成提供反應位點,還可吸附于納米硒的表面形成包覆層,對納米硒的穩定起重要作用,其中乙醇脫氫酶(AdhP)和SeNPs表面結合緊密,對SeNPs具有較強的保護作用,防止其聚集長大,制備中可控制納米硒的粒徑大小。

1.4 納米硒使用安全性高

納米硒急性毒性實驗研究發現[15,25-26],對無機硒(亞硒酸鹽)半數致死量LD50值為15.72 mg/kg BW,而納米硒則為112.98 mg/kg BW。與有機硒相比,納米硒同樣具有較高安全性,Wang等[27]采用硒代蛋氨酸和納米硒喂養小鼠,納米硒半數致死濃度LC50為92.1 mg/kg,硒代蛋氨酸的LC50為5.6 mg/kg,說明納米硒中毒的風險較低,而且納米硒過量(0.2～0.4 mg/kg BW)對小鼠沒有明顯毒性[28]。因此納米硒作為一種高活性、低毒的補硒產品將有望成為最佳的硒營養補充劑或治療藥物。

2 微生物合成納米硒的優勢

目前,納米硒的合成方法主要包括物理法、化學法和生物法。物理合成法采用高溫、高壓或者激光催化等轉化[29-30];化學法通過添加還原性試劑(如抗壞血酸、谷胱甘肽、碘化鉀、硫代硫酸鈉等)合成納米硒和穩定劑(蛋白質、多糖、多酚類物質和淀粉等)[27,31]避免納米顆粒聚合。生物合成法利用生物體在生長繁殖過程中產生的代謝產物或體內的酶系將無機硒還原成納米硒。

很多微生物可將無機硒轉化形成納米硒。微生物還原硒的原理主要是利用微生物的同化還原、異化還原和生物群落甲基化等,將水體、底泥、土壤等環境中Se(VI)和Se(IV)合成SeNPs,Se(VI)和Se(IV)可以作為微生物厭氧呼吸中的電子受體,通過參與細胞呼吸或還原、甲基化等脫毒途徑而被代謝,并在胞內積累或胞外分泌SeNPs[32]。因此微生物在硒的生態循環過程中起關鍵作用。與其它合成法相比,微生物合成納米硒具有眾多優勢。

2.1 微生物轉化納米硒條件溫和

微生物的生長環境最適溫度在25～37 ℃,在其生長繁殖過程中合成納米硒,而物理、化學法一般對條件要求較高,Mokhtar等[30]采用微波輻射合成納米硒,輻射功率750 W,在肼及表面活性劑作用下合成SeNPs,反應需要高溫環境。Triantis等[33]利用光產生的強反應活性制備出40、60、90 nm不同粒徑的納米硒顆粒,反應需要光激活氧化還原性。因此微生物合成納米硒相比轉化條件溫和,無需特定設備,安全性高,環保經濟。

2.2 微生物合成納米硒顆粒結構穩定

物理法需要高溫、高壓、催化劑等技術,制備的納米硒存在大小不均勻,生物活性差,結構不穩定性的現象[34];化學方法制備納米硒顆粒易團聚,因此需要加入蛋白質、多糖等分散劑或保護劑,使納米硒維持穩定結構和生理活性,程序復雜,易導致二次污染和純化困難。相比微生物合成納米硒顆粒對熱穩定,不易轉化為無活性的黑色或灰色單質硒,大小較為均一,呈規則的球狀,為單一標準結構的納米顆粒[35]。Fesharaki等[36]把肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)合成的SeNPs,在121 ℃下滅菌20 min,SeNPs沒有發生變化,說明微生物合成的SeNPs結構更穩定,可以耐高溫、高壓。Kessi等[37]發現紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)合成的SeNPs外層包裹蛋白質,形成Se-蛋白復合物,蛋白質能夠有效地避免無定形紅色納米顆粒發生轉化,起到穩定劑作用。

2.3 微生物合成的納米硒顆粒結構均勻,分散性好

研究發現化學合成SeNPs形狀不規則且粒徑相差較大,從20～50000 nm不等[38],目前物理化學法合成SeNPs在控制粒度大小和顆粒均勻上還有較大困難,因此也限制了SeNPs的工業化生產。微生物合成的納米硒粒徑多為17～500 nm之間[39-41],呈均勻、分散的球型。微生物在合成的過程中,菌體分泌的蛋白質或多糖等聚合物會均勻地包裹在納米單質硒顆粒外,起到天然的穩定劑或保護劑的作用,因此納米硒粒徑均勻、尺寸穩定、分散性好。

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3 合成納米硒的微生物種類

3.1 細菌

細菌具有代謝旺盛、繁殖能力強、營養要求低等特點,是研究微生物轉化合成SeNPs的主要類群。細菌轉化硒酸鹽或亞硒酸鹽合成SeNPs的研究較早,目前已經報道的既有厭氧菌又好氧菌,有光合細菌還有化能異養菌,均可以在菌體胞內或胞外多個位點還原亞硒酸鹽和硒酸鹽形成SeNPs。早在1981年,Sarathchandra等[42]在研究硒生物轉化時發現巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)可以轉化形成紅色的SeNPs。目前國內外報道SeNPs的轉化細菌較多,如糞腸桿菌(Enterobacterfaecalis)[43]、棒狀菌屬(Corynebacteriumspp.)[44]、乳酸菌(Lactobacillus)[45]、固氮紅細菌(Rhodoacterazotoformans)[46]、嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)[47]、假單胞菌(Pseudomonasalcaliphila)[48]以及銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[49]等。不同細菌在轉化能力方面有較大差異,硒還原菌必須首先能耐受高濃度的亞硒酸鹽或硒酸鹽的毒性,才能在繁殖過程中通過解毒途徑轉化合成納米硒,因此對細菌轉化SeNPs的研究主要注重尋找高耐受硒毒性的納米硒轉化菌及優化菌體的培養條件,提高轉化率[50]。目前對細菌合成納米硒已經進入還原機理的探究,結果表明納米硒在細菌內轉化部位較廣泛,細胞外、周質空間和細胞質內均可發生;既有酶促反應也有非酶促反應,但對于控制納米硒形成的關鍵性基因、蛋白質或酶,硒進入細菌的途徑及SeNPs的轉運方式等許多內部還原機理問題等還在探討中[51-52]。

表1 納米硒的應用Table 1 Application of nano-selenium

3.2 真菌

真菌主要包括單細胞的酵母及多細胞的霉菌和蕈菌,對金屬具有強的抵抗力和轉化積累效果[53]。真菌合成納米顆粒的研究較細菌稍晚,目前關于合成SeNPs的真菌報道還比較少,如木霉(Trichodermareesii)[54]、黑曲霉(Aspergillusniger)[54]、鐮刀菌(Fusariumsp)[54]、出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)[54]、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[55]等。真菌合成的納米硒可在胞內或胞外積累,不同菌合成納米硒尺寸差異較大,Zare等[56]從土壤樣本中篩選出一株土曲霉(Aspergillusterreus),在細胞外合成納米硒顆粒,粒徑約為47 nm。Vetchinkina等[57]發現香菇菌絲(Lentinulaedodes)可以還原轉化亞硒酸鈉為球形納米硒顆粒,并在菌絲內積累,粒徑大小在160～200 nm。

酵母可食用,富硒酵母安全性和生理活性較高,被認為是富硒的最佳載體,且生產周期相對較短,目前的研究主要關注利用食用酵母將亞硒酸鹽或硒酸鹽轉化為有機硒[58],用于開發功能性營養補硒食品和防治藥物,已在食品和飼料添加劑生產等方面得到良好應用[59]。但目前應用酵母轉化合成納米硒報道較少,主要針對釀酒酵母開展。Hariharan等[55]利用釀酒酵母在好氧條件下處理亞硒酸鈉溶液形成高度穩定的硒納米顆粒,納米顆粒尺寸范圍為30～100 nm。吳國杰[60]公開了一種納米硒的制備方法,采用啤酒發酵的酵母泥轉化亞硒酸鈉得到粒徑為30～40 nm的納米硒顆粒。釀酒酵母轉化納米硒具有重要的應用價值,可應用于開發富硒啤酒、果酒,提高酒中納米硒含量,因此篩選富納米硒釀酒酵母具有重要意義。

3.3 放線菌

目前已報道合成SeNPs放線菌較少,Forootanfara等[61]篩選到一株放線菌Streptomycesmicroflavusstrain FSHJ31,菌株轉化SeNPs的粒徑范圍介于28～123 nm之間。Tan等[62]從硒礦土壤中分離出一株好氧分枝放線菌菌株Streptomycessp.ES2-5,納米硒尺寸在50～500 nm之間。目前發現的轉化合成SeNPs的放線菌多為鏈霉菌屬類[40,63],說明此類放線菌轉化合成納米硒的能力較強,可能在鏈霉菌屬中含有較豐富的硒酸鹽還原酶,因此鏈霉菌屬是篩選轉化納米硒放線菌的主要類群。

3.4 原生動物

據報道原生動物也可以合成納米硒,但目前僅Cui等[64]報道嗜熱四膜蟲(TetrahymenathermophilaSB210)可合成納米硒,形成非晶態的球體納米硒顆粒,直徑為50～500 nm,并對SeNPs合成機理進行探索,發現有三種蛋白可能參與了SeNPs的合成過程。四膜蟲細胞結構和功能復雜性是非常有價值的生物模型,利用四膜蟲合成納米硒為研究SeNPs合成機理奠定了基礎。

4 納米硒功能性產品應用的前景

納米硒作為具有低毒、高效補硒和抗氧化、免疫調節、促進生長等藥理作用的硒形態,開發納米硒功能產品前景廣闊,具體應用情況見表1。

4.1 納米硒營養補充劑

補硒可以增強機體保護作用,調節機體的免疫功能,因此SeNPs在保健食品方面有著良好的應用前景。我國開發的“硒旺膠囊”主要成分為SeNPs,具有延緩衰老、免疫調節功能,已被國家衛生部正式批準為保健食品,在國內外硒營養補充保健品市場上具有強的競爭力。楊秀松等[65]采用貽貝提取物轉化合成納米硒貽貝粉,是良好的抗氧化劑和補硒制劑。納米硒保健食品研發已受到人們重視,國家專利局公開或授權的專利有納米硒鋅全營養素生產功能保健食品、康比硒、富硒茶、納米硒化牡蠣多糖固體飲料等[66]。

4.2 納米硒藥物的開發

納米硒可通過清除自由基、激活抗氧化硒酶的活性、增強抗氧化防御體系等多種方式發揮抗氧化作用。Zhai等[68]報道殼聚糖包裹的納米硒可清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和脂質過氧化物不同水平的自由基。納米硒對一些難控制細菌、真菌感染也很有效,可用于預防和治療金色葡萄球菌感染[43],抑制煙曲霉和白色念球菌的活性[69]。

4.3 納米硒飼料的開發

作為動物用飼料添加劑,腸道的吸收效果非常關鍵,納米級的單質硒顆粒小,比表面積大,與腸道粘膜接觸面積大,因而吸收效率好、利用率高。研究表明添加SeNPs的飼料可以提高動物生長速度、抗氧化、免疫力等功效,已在雞、鵝、豬、羊等畜禽中開展應用研究,但使用時需要嚴格控制納米硒的加量,避免產生毒性反應。王福香等[70]將納米硒喂養肉雞,發現了納米硒可以促進肉雞的生長、提高抗氧化能力。鄧岳松等[71]以亞硒酸鈉、硒蛋氨酸和SeNPs為飼料添加劑,研究尼羅羅非魚生長情況,結果表明低濃度不同形式硒都可有效地促進尼羅羅非魚生長,但較高濃度下只有SeNPs可明顯促進生長,相對安全性劑量范圍大于其他兩種硒形態。

4.4 富硒肥料開發

納米硒在促進植物生長、生產富硒農副產品上也表現出良好的效應。在植物生長過程中,硒能夠消除氧自由基,修復強光對葉綠素的破壞,增強葉片的光合作用[72],促進植物生長,并且增加果蔬含硒量。Domokos-Szabolcsy等[73]研究SeNPs和硒酸鹽對煙草的生物的影響,結果表明SeNPs對煙草器官的分化有明顯作用,可有效促進煙草根的生長。肖蘇堯等[74]合成了淀粉硒納米顆粒(St-Se0NP),并作為營養調節劑研究巨峰葡萄果實中硒含量的變化,結果表明在硒含量、糖份、鈣含量、酸度方面,St-Se0NP均優于對照組,明顯改善了葡萄的風味。SeNPs在植物方面的應用已受到重視,國家專利局已經授權果蔬類納米硒營養調節劑及其制備方法[75],公開專利多糖復合納米硒在富硒茶生產中的應用[76]。將SeNPs作為富硒肥料不僅有促于植物的生長[77],而且可用于生產富硒蔬果,對于改善果蔬品質具有重要意義。

4.5 環境污染治理

自然環境中存在的亞硒酸鹽和硒酸鹽都有較強的毒性,納米硒轉化菌可將其還原成安全性高、化學性質穩定的SeNPs,并且納米硒可吸附環境中重金屬離子形成金屬氧化物-納米硒復合物,以達到去除重金屬污染目的。目前硒還原菌已成功應用于環境改善、凈化污染等領域[78],如EnterococcuscloacaeSLD1a-1[79]已被運用于農業廢水中硒氧陰離子亞硒酸鹽和硒酸鹽的生物降解;Shewanellaputrefaciens200[80]和Geobactsulfurreducens[81]合成的SeNPs能夠結合環境中的HgO形成HgSe-NPs復合物,清除汞(Hg)的生物毒害作用。Jain等[82]研究發現,納米硒可優先吸收清除造紙廠廢水中銅離子,清除銅元素污染。

5 結語與展望

納米硒是一種紅色單質硒,具有低毒、高效的生理活性,粒徑是影響納米硒活性的重要因素。微生物轉化合成的SeNPs與化學法和物理法相比具有顯著優勢,轉化條件溫和,SeNPs結構穩定、均勻,分散性好。并且微生物對納米硒的轉化具有普遍性,細菌、真菌、放線菌、原生動物均能轉化合成SeNPs,在功能食品、藥物、肥料、飼料、環境污染治理等方面具有重要的應用前景。

微生物轉化納米硒盡管展現出良好使用價值,但還面臨諸多挑戰,首先,篩選到轉化能力強、適用于工業化生產的高產菌株是首先解決的關鍵問題,目前納米硒的生產成本高是制約納米硒廣泛應用的因素之一,因此需要在進一步研究納米硒合成機理、轉化基因的基礎上,利用現代化篩選方法、基因工程手段提高菌種轉化納米硒的能力,降低生產成本;其次,納米硒的活性與其粒徑大小有著密切的關系,微生物合成納米硒受菌種、營養、培養條件等諸多因素影響,控制粒徑是難點,也是未來研究的重要內容之一;第三,目前納米硒被應用于農業和畜牧業上作為肥料和飼料添加劑使用,但在食品應用和藥物治療上還面臨著挑戰,SeNPs在體內的藥物代謝動力學還不明確,尤其是對SeNPs在體內發揮生物效應的化學形式及作用機理還不清楚,未來研究需要跟蹤SeNPs在體內的代謝過程,研究SeNPs在體內和細胞的相互作用,為SeNPs應用于食品醫藥奠定基礎。