不同苦蕎茶中蘆丁和槲皮素含量測定及二者沖泡溶出率比較研究

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(1.山西振東制藥股份有限公司,山西長治 046000;2.山西中醫藥大學中藥與食品工程學院,山西晉中 030600)

苦蕎麥(Fagopyrumtataricum(L.)Gaertn)為蕎麥屬(蓼科)植物,是我國的重要小宗雜糧作物。其蛋白質、脂肪以及多種維生素和礦物質含量普遍高于其他禾谷類作物,營養價值較高,且富含蘆丁、槲皮素等黃酮類活性成分[1-3],具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等作用[4-9]。利用苦蕎麥開發的食品越來越受到消費者喜愛,苦蕎茶因食用方便、風味獨特,更是倍受青睞。李紅梅等[10]將苦蕎茶分為米茶型和造粒型兩類,分別測定其總黃酮含量,并按照分類進行比較分析。黃艷菲等[11]采用HPLC法測定不同商品苦蕎茶中蘆丁的含量,結果表明全胚茶中蘆丁含量最高。苦蕎中的黃酮成分主要是蘆丁和槲皮素,同時測定苦蕎茶中蘆丁和槲皮素的含量更能體現苦蕎茶質量[12]。同時,苦蕎茶主要被用來沖泡并飲用茶湯,進一步研究苦蕎茶經熱水沖泡后,其蘆丁、槲皮素的溶出率能更加直觀反映出消費者通過飲用苦蕎茶所攝入蘆丁、槲皮素的量[10]。

本文按照四川省地方標準《涼山苦蕎茶》將市售14款苦蕎茶分為:全麥(胚)苦蕎茶和造粒成型苦蕎茶兩類[13]。全麥(胚)苦蕎茶是以苦蕎麥為原料,經蒸煮、干燥、碾成米粒狀,再烘焙、包裝而成的苦蕎茶;造粒成型苦蕎茶以苦蕎麥、苦蕎植株全株或不同部分為基本原料,輔以天然食用配料,經篩選、研磨、混合、定型、烘焙、包裝而成的苦蕎茶[13]。采用HPLC法測定上述14款苦蕎茶中蘆丁、槲皮素含量[14],并對兩類苦蕎茶及其沖泡液中蘆丁、槲皮素的含量進行研究,以期為消費者選購苦蕎茶提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆丁 批號100080-201409,純度91.9%,中國食品藥品檢定研究院;槲皮素 批號100081-201610,純度99.1%,中國食品藥品檢定研究院;甲醇 色譜純,OCEANPAK;純水 娃哈哈純凈水;其余試劑均為分析純;苦蕎茶樣品 均購于網絡旗艦店,見表1。

表1 苦蕎茶樣品Table 1 Tartary buckwheat tea sample

UltiMate 3000高效液相色譜儀 賽默飛世爾科技;CP124C電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;EX125ZH電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司;KQ5200E型超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;Phenomenex C18色譜柱(250 mm×4.60 mm,5 μm) 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 蘆丁、槲皮素含量的測定

1.2.1 溶液的制備 對照品溶液的制備:取蘆丁對照品、槲皮素對照品適量,精密稱定,加甲醇分別制成每1 mL含蘆丁0.1 mg、槲皮素0.02 mg的混合溶液。

供試品溶液的制備:苦蕎茶,粉碎(過50目篩)取約1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加熱回流2次,每次精密加入70%甲醇50 mL,回流30 min,搖勻,濾過,合并濾液,置100 mL量瓶中,加70%甲醇至刻度,搖勻,即得。

1.2.2 色譜條件 Phenomenex C18色譜柱(250 mm×4.60 mm,5 μm);以甲醇為流動相A,以0.1%冰醋酸溶液為流動相B,按表2中的條件進行梯度洗脫;流速為1.0 mL·min-1;柱溫為30 ℃;檢測波長為257 nm。混合對照品溶液、供試品溶液、甲醇溶液各取10 μL注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖。

表2 梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions

1.3 方法學考察

1.3.1 線性關系 精密稱取蘆丁、槲皮素對照品適量,加甲醇溶解,逐級稀釋,使其質量濃度蘆丁(以蘆丁質量濃度計)分別為0.00362、0.00906、0.01812、0.03625、0.18122、0.45307、0.90613 mg·mL-1,槲皮素(以槲皮素濃度計)分別為0.01439、0.02878、0.05756、0.28779、0.71947 mg·mL-1。分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀,按1.2.2項下色譜條件測定峰面積。

1.3.2 精密度實驗 取樣品S11,按1.2.1項制備供試品溶液并精密吸取10 μL,連續進樣6次,測定峰面積,計算RSD值。

1.3.3 穩定性實驗 1.3.2項所制備供試品溶液在0、2、4、6、8、10、12 h分別進樣10 μL,測定峰面積,計算RSD值。

1.3.4 重復性實驗 取樣品S11,按1.2.1項制備供試品溶液5份,分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀,測定峰面積,并計算樣品中蘆丁、槲皮素含量的RSD。

表3 蘆丁加樣回收率實驗結果Table 3 Test result of the rate of rutin recovery

1.3.5 加樣回收率實驗 稱取已知含量的樣品S11粉末9份,每份0.25 g,分別精密加入對照品溶液(蘆丁質量濃度為1.15 mg·mL-1,槲皮素質量濃度為0.36 mg·mL-1)各1 mL,2 mL,3 mL,每個梯度平行3份,定容到25 mL,按供試品溶液的制備方法制備得供試品溶液。按1.2.2項下色譜條件測定,計算回收率。

1.4 蘆丁、槲皮素含量測定

1.4.1 不同苦蕎茶中蘆丁、槲皮素含量測定 將市售14款苦蕎茶按1.2.1中方法制備供試品溶液,按1.2.2項下色譜條件測定。

1.4.2 不同苦蕎茶沖泡液中蘆丁、槲皮素含量測定 將市售14款苦蕎茶分別準確稱取2 g,置于燒杯中,向杯中注入100 mL沸水,沖泡5 min,過濾,連續沖泡6次,收集茶湯,合并后計量茶湯體積,作為待測樣品,測定其蘆丁、槲皮素含量。根據測定結果計算苦蕎茶沖泡后蘆丁(槲皮素)溶出率及總溶出率。計算公式為:

蘆丁(槲皮素)溶出率(%)=沖泡液中蘆丁(槲皮素)含量/苦蕎茶中蘆丁(槲皮素)含量×100

總溶出率(%)=(沖泡液中蘆丁含量+沖泡液中槲皮素含量)/(苦蕎茶中蘆丁含量+苦蕎茶中槲皮素含量)×100

1.5 數據處理

實驗平行3次,實驗數據用平均值±標準差表示。采用SPSS Statistics 22進行數據統計分析和圖形繪制,色譜圖的疊加和處理,采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2.0版)。

2 結果與分析

2.1 蘆丁、槲皮素含量測定方法學考察

2.1.1 系統適用性試驗 按1.2.2色譜條件,取對照品溶液、供試品溶液和溶劑分別進樣記錄色譜圖,見圖1。由圖1可知,蘆丁和槲皮素與雜質峰達到了較好的基線分離,溶劑對其含量測定無影響。供試品溶液中蘆丁、槲皮素保留時間分別為6.273、8.820 min,理論塔板數分別為13584、16637,分離度大于10。

圖1 對照品溶液(A)、樣品溶液(B)及溶劑(C)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference solution(A),sample solution(B)and solvent(C)注:1:蘆丁,2:槲皮素。

2.1.2 線性關系 以對照品溶液質量濃度(mg·mL-1)為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,得蘆丁線性線回歸方程:Y=332.91X+0.45(X濃度、Y峰面積,r=0.9996),在0.00362～0.90613 mg·mL-1范圍內呈良好線性關系;槲皮素線性線回歸方程:y=626.25x+0.51,(x濃度、y峰面積,r=0.9998),在0.01439～0.71947 mg·mL-1范圍內呈良好線性關系。

2.1.3 精密度實驗 連續進樣6次,蘆丁峰面積RSD為0.12%,槲皮素峰面積RSD為0.13%,表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩定性實驗 在0、2、4、6、8、10、12 h分別進樣10 μL,蘆丁峰面積的RSD為0.69%,槲皮素峰面積的RSD為1.10%,表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

表4 槲皮素加樣回收率試驗結果Table 4 Test results of the rate of quercetin recovery

2.1.5 重復性實驗 精密吸取5份供試品溶液10 μL,進樣,測定峰面積,蘆丁的質量濃度為9.17 mg·g-1,RSD為1.71%;槲皮素的質量濃度為3.17 mg·g-1,RSD為2.13%。表明方法重復性良好。

2.1.6 加樣回收率實驗 9份供試品按1.2.2項下色譜條件測定,計算回收率,見表3、表4,蘆丁、槲皮素的回收率分別為101.99%、98.37%,RSD分別為1.71%、2.03%。表明建立的方法準確度良好。

表5 不同苦蕎茶樣品中蘆丁和槲皮素含量測定Table 5 Content of rutin and quercetin in different tartary buckwheat tea

2.2 不同苦蕎茶中蘆丁、槲皮素含量測定

市售14款苦蕎茶中蘆丁、槲皮素含量測定結果如表5所示。造粒成型苦蕎茶中槲皮素含量較高;而全麥(胚)苦蕎茶中蘆丁含量較高。造粒成型苦蕎茶中蘆丁含量較全麥(胚)苦蕎茶低,樣品S4、S6中蘆丁含量不足1.0 mg·g-1,而槲皮素含量和蘆丁、槲皮素總量除樣品S6外均高于全麥(胚)苦蕎茶。全麥(胚)苦蕎茶樣品S8、S12～S14中,槲皮素含量不足0.5 mg·g-1。

Germ、孫曉靜等[15-16]研究發現,苦蕎中槲皮素常以苷(即蘆丁)的形式存在,造粒成型苦蕎茶在制粒的過程中加入水,使蘆丁在酶的作用下發生水解生成槲皮素。因此,造粒成型苦蕎茶中槲皮素含量較高,而蘆丁含量較少。全麥(胚)苦蕎茶通過蒸煮工序使酶迅速失活,蘆丁水解成槲皮素的量較少,槲皮素含量也較少[17-18]。邵美紅等[19-21]研究表明,苦蕎葉、花中的總黃酮含量較高,而根、莖、麩皮、種子中的含量較低。造粒成型苦蕎茶在制作中,加入了黃酮含量較高的葉、花,故造粒成型苦蕎茶產品中的蘆丁和槲皮素總量較高。本研究結果與前人研究結果一致。

2.3 不同苦蕎茶沖泡液中蘆丁、槲皮素含量測定

不同苦蕎茶沖泡液中蘆丁、槲皮素含量測定結果如表6所示,并結合表5中對應苦蕎茶中蘆丁、槲皮素含量計算其溶出率。蘆丁溶出率可高達102.38%,槲皮素溶出率最高僅27.43%。造粒成型苦蕎茶S4沖泡液中未檢出蘆丁,全麥(胚)苦蕎茶S8、S13、S14中槲皮素含量較低,其沖泡液中未檢出槲皮素。造粒成型苦蕎茶沖泡液中以槲皮素為主,而全麥(胚)苦蕎茶沖泡液中以蘆丁為主,除S10、S11外,槲皮素含量均不足0.1 mg·g-1。沖泡液中蘆丁、槲皮素總量和總溶出率除S11外,全麥(胚)苦蕎茶>造粒成型苦蕎茶。

表6 不同苦蕎茶沖泡液中蘆丁和槲皮素含量測定Table 6 Content of rutin and quercetin in brewing solution of different tartary buckwheat tea

由表7結果可知,造粒成型苦蕎茶中蘆丁、槲皮素總量17.34 mg·g-1,且槲皮素占比達89.10%,其沖泡液中蘆丁、槲皮素溶出量分別為0.46、2.83 mg·g-1,總溶出率19.41%。全麥(胚)苦蕎茶中蘆丁、槲皮素總量11.96 mg·g-1,蘆丁占91.39%,其沖泡液中蘆丁、槲皮素溶出量分別為7.85、0.09 mg·g-1,總溶出率67.86%。苦蕎茶中蘆丁、槲皮素總量:造粒成型苦蕎茶>全麥(胚)苦蕎茶,且差異顯著(P<0.05);苦蕎茶沖泡液中蘆丁、槲皮素總量及總溶出率:造粒成型苦蕎茶<全麥(胚)苦蕎茶,且差異極顯著(P<0.01)。

表7 造粒成型苦蕎茶和全麥(胚)苦蕎茶蘆丁、槲皮素含量及溶出率比較Table 7 Comparison of rutin and quercetin contents and dissolution ratein granulated tartary buckwheat tea and whole wheat(embryo)tartary buckwheat tea

不同類型苦蕎茶沖泡液中,蘆丁、槲皮素的溶出率呈現不同的規律。造粒成型苦蕎茶經擠壓成型,顆粒較緊實,成分較難溶出,且其含量較高的槲皮素水溶性較差(小于0.1 g/100 mL)[22],故總溶出率較低。而全麥(胚)苦蕎茶在加工中會進行膨化處理,籽粒較疏松,且其含量較高的蘆丁水溶性優于槲皮素[23-24],故總溶出率較高,結合表6可知,部分產品經多次沖泡后,其蘆丁能夠完全溶出。

2.4 不同苦蕎茶及其沖泡液中蘆丁、槲皮素含量的聚類分析

聚類分析是將樣品按照品質特性相似程度逐漸聚合在一起,最終按照類別的綜合性質多個品種聚合,從而完成聚類分析的過程[25-26]。本文以不同苦蕎茶蘆丁、槲皮素含量及其沖泡液中蘆丁、槲皮素溶出率為指標,采用組間平均數聯結法,結合平方Euclidean 距離,對14款苦蕎茶進行聚類分析結果見圖2。

圖2 苦蕎茶樣品聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram of cluster analysis oftartary buckwheat tea samples

由圖2可知,14款苦蕎茶可分成2類,第一類包括樣品S1～S6,為造粒成型苦蕎茶,該類樣品特征為苦蕎茶中蘆丁、槲皮素之和較高(平均含量17.34 mg·g-1),其中槲皮素占89.10%;沖泡液中蘆丁、槲皮素之和(平均含量3.28 mg·g-1)較低,總溶出率較低(平均溶出率19.41%)。第二類包括樣品S7～S14,為全麥(胚)苦蕎茶,該類樣品特征為苦蕎茶中蘆丁、槲皮素之和較低(平均含量11.96 mg·g-1),其中蘆丁占91.39%;沖泡液中蘆丁、槲皮素之和(平均含量7.94 mg·g-1)較高,總溶出率較高(平均溶出率67.86%)。聚類結果將不同苦蕎茶按照其蘆丁、槲皮素含量和沖泡液中蘆丁、槲皮素溶出率的差異性區分開,反映了造粒成型苦蕎茶和全麥(胚)苦蕎茶之間的差異性。

3 結論

本實驗建立HPLC法同時測定苦蕎茶及其沖泡液中蘆丁和槲皮素的含量,該方法簡便快捷,檢測結果準確。通過對不同苦蕎茶及其沖泡液中蘆丁、槲皮素含量的比較得出:造粒成型苦蕎茶中蘆丁、槲皮素總量顯著高于全麥(胚)苦蕎茶(P<0.05);但由于造粒成型苦蕎茶中蘆丁、槲皮素較難溶出,其沖泡液中蘆丁、槲皮素總量極顯著低于全麥(胚)苦蕎茶(P<0.01)。消費者在選擇苦蕎茶產品時,如僅飲用其沖泡液(即茶湯),選全麥(胚)苦蕎茶能夠獲取更多的蘆丁、槲皮素;如在飲用茶湯的同時將茶渣一起食用,選造粒成型苦蕎茶能夠獲取更多的蘆丁、槲皮素。