虎奶菇MnSOD提取、鑒定及基因的克隆

楊加亮,田云恒,馬愛民

(華中農業大學食品科學技術學院,湖北武漢 430070)

虎奶菇(Pleurotustuber-regium(Fr.)Sing)屬于擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、側耳科、側耳屬,又稱菌核側耳,是熱帶地區一種珍貴的食藥真菌[1],主要分布在我國云南省以及緬甸和非洲的尼日利亞等地[2]。虎奶菇營養價值豐富,含有真菌多糖、礦物質及生物活性酶等多種具有抗氧化功能的活性成分[3]。虎奶菇抗氧化方面的研究主要集中在對虎奶菇多糖的研究[4-6],對于同樣具有抗氧化作用的生物活性酶的研究不多。

本研究提取了虎奶菇Mn-SOD,通過酶活測定和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳活性染色等方法鑒定虎奶菇Mn-SOD。通過同源克隆、cDNA末端快速擴增技術和融合引物與巢式PCR等方法從虎奶菇中克隆獲得一個虎奶菇Mn-SOD基因,利用在線工具進行生物信息學分析,同時采用鄰接法構建系統進化樹,從基因及其編碼的蛋白來研究虎奶菇Mn-SOD的理化性質和結構特點。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

虎奶菇菌株(Pleurotustuber-regium(Fr.)Sing) 華中農業大學食品微生物實驗室提供,32 ℃保存于PDA斜面培養基上;大腸桿菌感受態DH5α北京全式金生物技術有限公司;pMD18-T質粒、DNA ligation kit ver. 2.1、RNAiso plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit、M-MLV RTase cDNA synthesis kit TaKaRa公司;E.Z. N.ATMCycle-pure Kit、Gel Extraction Kit、Plasmid DNA Mini Kit I Omega公司;氨芐青霉素 Sigma-Aldrich;Trans2K Plus DNA Marker、Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker、Taq DNA polymerase 北京全式金生物技術有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒 武漢谷歌生物科技有限公司;核黃素、氮藍四唑(NBT) Sigma-Aldrich;CuZn/Mn-SOD活性檢測試劑盒(WST-8法) 碧云天生物技術公司;引物的合成和序列的測定 武漢天一輝遠有限公司。

梯度PCR儀 BioRad;DYY-8C型電泳儀、DYCP-31DN型水平電泳槽 北京六一儀器廠;Centrifuge 5415R冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司;熱電FC酶標儀 美國Thermo scientific公司;STUART SA8漩渦振蕩混合器 vedgen;GEL LOGICAL 200凝膠成像系統 美國Kodak公司;VCX500超聲破碎儀 美國Sonics公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 虎奶菇Mn-SOD的提取及鑒定

1.2.1.1 虎奶菇Mn-SOD的提取 方法參照高建華等[19]方法,取3 g虎奶菇菌絲用液氮研磨,按每1 g虎奶菇菌絲加入4 mL磷酸緩沖液(50 mmol/L,pH7.8,含0.1 mmol/L EDTA),放在振蕩器上洗滌30 min,4000 r/min離心20 min,收集上清液與沉淀,上清液備用,沉淀為菌絲體;每克沉淀加入1 mL磷酸鹽緩沖液懸浮,100 W超聲波破壁5 min,靜置提取30 min,4000 r/min離心20 min,收集上清液,與原上清液混合,此即SOD粗提液。粗提液加硫酸銨至30%飽和度,冰浴、攪拌2 h后,4 ℃、10000 r/min離心10 min。取上清液并再加硫酸銨至85%飽和度,冰浴、攪拌2 h后,4 ℃、10000 r/min離心10 min,收集沉淀,計算回收率,公式如下:

式中:m表示虎奶菇菌絲加入量,g;m1表示處理回收得到的沉淀,g。

沉淀用少量的磷酸緩沖液溶解,即得鹽析液。將鹽析液放入透析袋用磷酸緩沖液透析過夜。每隔1 h換一次緩沖液,透析過程中充分攪拌,即得透析液。

1.2.1.2 虎奶菇Mn-SOD的酶活力測定 用WST-8法測定虎奶菇Mn-SOD的酶活力。按照碧云天公司CuZn/Mn-SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)[20]推薦步驟處理。在37 ℃環境中反應30 min,測定在波長450 nm下的吸光值。由空白對照組和樣品的吸光值可計算出抑制百分率,公式如下:

當抑制百分率為50%時,反應體系中的SOD酶活力定義為1個酶活力單位(U)。根據抑制百分率可計算出酶活力單位,公式如下:

1.2.1.3 虎奶菇Mn-SOD的鑒定 采用抑制劑敏感性實驗鑒定酶的種類。所采用的抑制劑為H2O2。取兩份透析液,一份加入H2O2溶液;一份不加入H2O2溶液。混勻后取相同體積樣品進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,參照Yin等[21]方法。凝膠采用12%分離膠和5%濃縮膠。樣品進行非變性電泳后,凝膠取出洗凈,放入25 mL NBT(2.45 mmol/L)溶液中浸泡45 min,簡單洗后在黑暗環境中再放入30 mL磷酸緩沖液(50 mmol/L、pH=7.8、含28 mmol/L四甲基乙二胺(TEMED)和0.028 mmol/L核黃素)中浸泡30 min。染色完成后,膠放入磷酸緩沖液(50 mmol/L、pH=7.8、含0.1 mmol/L EDTA)中,4×8 W日光燈下光照30 min,直至背景上有清晰透明的SOD活性譜帶。

1.2.2 虎奶菇Mn-SOD基因的克隆

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.2.2.1 基因組DNA的提取 虎奶菇基因組的提取采用改進的CTAB法[22],將培養的虎奶菇菌絲體用液氮研磨成粉末,取20 mg左右至1.5 mL離心管中;取700 μL Extraction Buffer至離心管,70 ℃水浴30 min,每10 min顛倒一次;加等體積PCA,混勻,12000 r/min,室溫離心15 min;上清轉管,加等體積-20 ℃預冷的異丙醇,混勻,室溫沉淀10 min,12000 r/min,4 ℃離心10 min,棄上清;加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀,12000 r/min,4 ℃離心3 min,室溫干燥;加入 20 μL 1×TE Buffer溶解DNA,樣品于-20 ℃保存備用。

1.2.2.2 總RNA的提取和cDNA第一條鏈的合成 虎奶菇菌絲總RNA的提取采用Trizol法,以提取的總RNA為模板采用PrimeScriptTMRT reagent Kit 反轉錄成cDNA,操作參照試劑盒說明書,合成的cDNA用于基因克隆。采用M-MLV RTase cDNA synthesis kit,使用錨定引物AP(表1)將RNA轉錄成cDNA,命名為cDNA 1,合成的cDNA 1用于克隆虎奶菇Mn-SOD基因3′端cDNA片段。RNA和cDNA樣品保存于-80 ℃備用。

1.2.2.3 虎奶菇Mn-SOD基因cDNA保守片段的克隆 根據NCBI和JGI數據庫中糙皮側耳(Pleurotusostreatus)、晶粒鬼傘(Coprinellusmicaceus)、茯苓(Wolfiporiacocos)、灰光柄菇(Pluteuscervinus)和香菇(Lentinulaedodes)等擔子菌的Mn-SOD氨基酸序列,分析保守區域,設計簡并引物MnSod1-F和MnSod1-R(表1)擴增Mn-SOD基因cDNA保守片段。以cDNA為模板進行PCR擴增,條件如下:預變性94 ℃,5 min;變性94 ℃,1 min;退火54 ℃,30 s;延伸72 ℃,1 min;循環數30;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。取50 μL PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳,切下與目的條帶位置大小接近的條帶,用E.Z.N.ATMGel Extraction kit 膠回收試劑盒的方法進行回收。回收片段與pMD18-T載體連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,經氨芐青霉素(100 μg/mL)抗性篩選及菌落PCR驗證后,選擇陽性克隆,送武漢天一輝遠公司進行測序,獲得虎奶菇Mn-SOD基因的保守片段cDNA序列。

1.2.2.4 虎奶菇Mn-SOD基因3′端cDNA片段的克隆 用RACE技術(Rapid amplification of cDNA end,cDNA末端快速擴增技術)克隆虎奶菇Mn-SOD基因3′端cDNA片段。根據1.2.2.3中獲得的虎奶菇Mn-SOD基因保守區域cDNA序列,設計3′RACE引物SOD-RF與合成的引物AUAP(表1),以1.2.2.2中cDNA 1為模板,進行PCR擴增,條件如下:預變性94 ℃,5 min;變性94 ℃,1 min;退火58 ℃,30 s;延伸72 ℃,1 min;循環數30;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。PCR產物進行同1.2.2.3處理,挑選陽性克隆,進行測序。拼接3′端cDNA序列與保守片段cDNA序列,得到包含保守片段的3′端cDNA片段。

1.2.2.5 虎奶菇Mn-SOD基因5′端DNA片段的克隆 利用FPNI-PCR(Fusion primer and nested integrated PCR,融合引物與巢式PCR)技術克隆虎奶菇錳超氧化物歧化酶基因5′端DNA片段。根據1.2.2.4中包含保守片段的3′端cDNA片段,設計引物SODF和SOD-R(表1),以DNA為模板,擴增出虎奶菇Mn-SOD基因3′端DNA片段,測序得到DNA序列。按照FPNI-PCR引物設計要求,設計三個由近及遠的下游特異引物SP1、SP2和SP3(表1)。以虎奶菇DNA為模板,以SP3、SP2、SP1分別與合成的FP2、FSP1、FSP2(表1)組成引物對,進行三輪PCR[23]。第二輪和第三輪PCR產物進行同1.2.2.3處理,挑選陽性克隆,進行測序,獲得虎奶菇Mn-SOD基因5′端DNA序列。

1.2.2.6 虎奶菇Mn-SOD基因的克隆 將1.2.2.5中獲得的虎奶菇Mn-SOD基因5′端DNA序列和3′端DNA序列通過軟件DNAMAN 6.0進行拼接,剔除重疊部分。把拼接結果通過NCBI數據庫進行BLASTx比對,設計引物SOD-F(表1)與SOD-R分別以DNA和cDNA為模板擴增虎奶菇Mn-SOD基因全長的DNA和cDNA片段,PCR擴增,條件如下:預變性94 ℃,5 min;變性94 ℃,1 min;退火58 ℃,30 s;延伸72 ℃,1 min;循環數30;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。PCR產物進行同1.2.2.3處理,挑選陽性克隆,進行測序,獲得虎奶菇Mn-SOD基因的DNA和cDNA序列。

1.2.3 虎奶菇Mn-SOD基因的生物信息學分析

1.2.3.1 虎奶菇Mn-SOD基因序列的生物信息學分析 用NCBI數據庫中BLASTx(https://blast. ncbi. nlm. nih.gov/Blast.cgi)進行基因序列比對;利用軟件Editseq對拼接結果進行分析,尋找開放閱讀框(ORF);用軟件DNAMAN 6.0對得到的基因DNA序列和cDNA序列進行比對,預測內含子情況,并將cDNA序列翻譯成氨基酸序列,便于對編碼的蛋白進行分析。

圖2 PtMn-SOD基因的克隆Fig.2 Cloning of PtMn-SOD gene注:M:Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker;M1:Trans2K Plus DNA Marker;A:虎奶菇菌絲體DNA提取電泳檢測結果,其中泳道1是虎奶菇菌絲體DNA;B:虎奶菇菌絲RNA提取電泳檢測結果,其中泳道1是虎奶菇菌絲體RNA;C:PtMn-SOD基因保守區域cDNA片段PCR結果,其中泳道1是保守區域cDNA片段擴增產物;D:PtMn-SOD基因3′RACE PCR結果,其中泳道1是3′端cDNA片段擴增產物;E:PtMn-SOD基因3′端片段PCR結果,其中泳道1是3′端DNA片段擴增產物;F:PtMn-SOD基因5′端FPNI-PCR結果,其中泳道1是FPNI-PCR第二輪擴增產物,泳道2是FPNI-PCR第三輪擴增產物;G:PtMn-SOD基因全長DNA和cDNA PCR結果,其中泳道1是DNA擴增產物,泳道2是cDNA擴增產物。

1.2.3.2 虎奶菇Mn-SOD基因編碼蛋白的生物信息學分析 用在線ProtParam tool(http://web. expasy. org/protparam/)分析氨基酸基本理化性質;利用在線Prosite(https://prosite.expasy.org/scanprosite/)分析蛋白的功能位點;利用在線Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對不同物種間Mn-SOD蛋白進行多序列比對;利用軟件MEGA 5.1,采用鄰接法構建系統進化樹;用在線軟件DAS-TMfilter(http://mendel.imp.ac.at/sat/DAS/DAS.html)進行跨膜結構預測;用SignaIP 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)分析蛋白的信號肽情況;用軟件PSORT(http://psort.nibb.ac.jp/)進行亞細胞定位;利用在線分析工具SOMPA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預測蛋白的二級結構;借助Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/interactive)對Mn-SOD蛋白進行三維結構預測并構建3D模型。

2 結果與分析

2.1 虎奶菇 Mn-SOD 提取及鑒定

2.1.1 虎奶菇Mn-SOD提取 將3 g虎奶菇菌絲體,經研磨、超聲、硫酸銨沉淀,收集到沉淀0.45 g。回收率為15%。透析處理之后,得到酶液。

2.1.2 虎奶菇Mn-SOD酶活的測定 用WST-8法測定Mn-SOD酶活,結果表明酶液能有效抑制甲臜染料的生成,表現出明顯的抗氧化活性。抑制百分率分別為62.3%,計算出虎奶菇Mn-SOD酶活力為1.66個酶活力單位。

2.1.3 虎奶菇Mn-SOD的鑒定 由于Mn-SOD對H2O2具有一定的抗性[16],因此可以用H2O2鑒定虎奶菇SOD的類型,非變性PAGE膠活性染色結果如圖1所示。由圖1可知,酶經過H2O2處理后仍然有一定的活性,與未處理無明顯差異,表明虎奶菇中SOD主要是Mn-SOD。

圖1 虎奶菇Mn-SOD鑒定Fig.1 Identification of Mn-SOD from P. tuber-regium注:1:未添加H2O2的透析液;2:添加H2O2的透析液。

2.2 虎奶菇Mn-SOD基因的克隆

圖2(A、B)分別是提取的DNA和RNA電泳檢測圖。利用簡并引物MnSod1-F和MnSod1-R擴增獲得了373 bp的保守區域cDNA片段(圖2C)。3′RACE反應獲得了約339 bp的3′端cDNA序列(圖2D),與保守序列拼接,得到含有564 bp的3′端cDNA序列。使用引物SODF和SOD-R擴增,得到含有792 bp的3′端DNA序列(圖2E)。FPNI-PCR反應獲得了約1900 bp的5′端DNA序列(圖2F)。將5′端和3′端序列進行拼接。用引物SOD-F與SOD-R擴增虎奶菇Mn-SOD基因的DNA及cDNA(圖2G),測序結果與相應拼接序列完全一致,命名該基因為PtMn-SOD。

圖4 基因PtMn-SOD內含子序列結構圖Fig.4 The intron positions in the PtMn-SOD gene

2.3 虎奶菇Mn-SOD基因的生物信息學分析

2.3.1 虎奶菇Mn-SOD基因序列的生物信息學分析 經過NCBI數據庫中BLASTx比對,發現與糙皮側耳(登錄號:MH645359.1)的Mn-SOD基因序列同源性達到79%,初步確認已成功獲得虎奶菇Mn-SOD基因。使用軟件Editseq對序列起始密碼子、終止密碼子的位置進行預測。虎奶菇PtMn-SOD基因的DNA序列全長1025 bp和cDNA序列全長747 bp。其中開放閱讀框(ORF)長為663 bp,編碼220個氨基酸(圖3)。

圖3 基因PtMn-SOD的cDNA序列及推導的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and amino acid sequence of PtMn-SOD gene注:陰影部分為Mn-SOD蛋白的保守區域。

使用DNAMAN 6.0軟件對得到的PtMn-SOD基因DNA序列和cDNA序列進行分析,發現PtMn-SOD具有7個內含子(圖4),這七個內含子的序列長度分別為50、50、51、52、54、54和51 bp。第一、第二和第五個內含子的剪切規則為TA-GG,第三個內含子的剪切規則為TG-GG,第四、第六和第七個內含子的剪切規則為GT-AG。

2.3.2 虎奶菇Mn-SOD基因編碼蛋白的生物信息學分析 經ProtParam軟件分析可知PtMn-SOD基因所編碼蛋白質的分子式是C1112H1706N300O323S3,分子量為24.54 kDa,理論等電點為7.86,屬于堿性蛋白。負電荷殘基(Asp+Glu)數為22個,正電荷殘基(Arg+Lys)數為 23個。不穩定系數為34.09,屬于穩定蛋白質;脂肪系數為81.68。總平均親水性為-0.366,預測該蛋白是親水性蛋白。

對蛋白質進行功能位點分析,發現在第181～188位氨基酸之間有Mn-SOD蛋白特征位點,即DIWEHAFY。把Mn-SOD蛋白氨基酸序列與茯苓、晶粒鬼傘、香菇、草菇、糙皮側耳、奧氏蜜環菌(Armillariasolidipes)、高盧蜜環菌(Armillariagallica)、乳白蛋巢菌(Crucibulumlaeve)和灰光柄菇等九種真菌的Mn-SOD蛋白進行多序列比對,發現PtMn-SOD蛋白與九種真菌的Mn-SOD蛋白具有高度的相似性(75%以上)(圖5),進一步證明已成功獲得虎奶菇Mn-SOD基因PtMn-SOD。

圖5 PtMn-SOD蛋白與其他真菌Mn-SOD蛋白的多序列比對Fig.5 Multiple sequence alignment of PtMn-SOD protein with Mn-SOD of other fungi注:加框部分為Mn-SOD蛋白的特征位點。

在NCBI數據庫中下載15種擔子菌(奧氏蜜環菌(Armillariasolidipes)、高盧蜜環菌(Armillariagallica)、乳白蛋巢菌(Crucibulumlaeve)、灰光柄菇(Pluteuscervinus)、草菇(Volvariellavolvacea)、蟹味菇(Hypsizygusmarmoreus)、熒光小菇(Mycenachlorophos)、香菇(Lentinusedodes)、晶粒鬼傘(Coprinusmicaceus)、糙皮側耳(Pleurotusostreatus)、Heterobasidionirregulare、毛韌革菌(Stereumhirsutum)、絨毛栓菌(Trametespubescens)、茯苓(Wolfiporiacocos)和硫磺菌(Laetiporussulphureus))的Mn-SOD蛋白氨基酸序列,將這些序列與PtMn-SOD蛋白氨基酸序列進行同源性比對,采用鄰接法構建系統進化樹。如圖6所示,該系統發育樹由兩個大聚類組成,其中絨毛栓菌、硫磺菌和茯苓三個多孔菌科的擔子菌組成一個大聚類,另外13種擔子菌組成另一個大聚類。在這13種擔子菌中,又分為三個小聚類,其中虎奶菇、糙皮側耳和晶粒鬼傘組成一個小聚類,PtMn-SOD與同屬于側耳屬的糙皮側耳的進化距離最近。聚類分析表明,虎奶菇與糙皮側耳親緣關系較近,可能由同一個始祖進化而來。

圖6 基于16種真菌Mn-SOD蛋白氨基酸序列的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic trees based on the amino acid sequences of Mn-SOD protein from 16 kinds of fungi

運用在線軟件DAS-TMfilter進行跨膜結構預測可知,PtMn-SOD蛋白沒有跨膜結構域,屬于非跨膜蛋白。信號肽的預測和分析有助于理解蛋白質亞細胞定位。用在線軟件SignaIP 4.0預測了PtMn-SOD蛋白屬于非分泌蛋白,沒有信號肽,這說明PtMn-SOD蛋白可能是在細胞膜內發揮作用(圖7)。這和跨膜結構域預測的結果一致。Psort軟件預測表明,PtMn-SOD蛋白定位于線粒體,推斷該基因編碼的蛋白是一種線粒體蛋白,在線粒體內發揮功能,參與超氧陰離子的清除反應。

圖7 信號肽預測Fig.7 The prediction of signal peptide

通過SOMPA預測PtMn-SOD蛋白的二級結構,其二級結構包括41.82%的α-螺旋、15.45%的延伸鏈和42.73%的無規卷曲。如圖8所示,螺旋和無規卷曲是PtMn-SOD蛋白最大的結構元件,貫穿于整個蛋白質結構中,而延伸鏈較少,分散其中。

圖8 二級結構預測Fig.8 Secondary structure prediction

線蟲的Mn-SOD蛋白(PDB ID:4X9Q)[24]與PtMn-SOD蛋白序列相同部分超過60.85%,因此該線蟲的Mn-SOD蛋白可以作為同源建模的模板。依據同源建模的方法,借助Swiss-model,以該線蟲的Mn-SOD蛋白為模板,對PtMn-SOD蛋白進行三維結構預測并構建3D模型(圖9)。蛋白的三維結構很可能主要是由α-螺旋、延伸鏈和無規卷曲組成,與二級結構預測分析結果一致。該蛋白以同源四聚體的形式存在,可結合4個錳離子。蛋白的三維結構更進一步證明已成功獲得虎奶菇Mn-SOD基因PtMn-SOD。

圖9 PtMn-SOD蛋白的三維立體結構Fig.9 3-D structure of the deduced protein of PtMn-SOD

3 結論

以虎奶菇菌絲體為材料,通過研磨、超聲、硫酸銨沉淀和透析,提取Mn-SOD。用WST-8法測Mn-SOD酶活力虎奶菇Mn-SOD酶活力為1.66個酶活力單位。用H2O2鑒定虎奶菇SOD的類型，酶經過H2O2處理后仍然有一定的活性,與未處理無明顯差異,表明虎奶菇中SOD主要是Mn-SOD。通過同源克隆、RACE技術和FPNI-PCR等方法從虎奶菇中克隆獲得一個PtMn-SOD基因,進行生物信息學分析。分別從基因序列、編碼蛋白的功能位點和編碼蛋白三維結構等方面,證明獲得的是SOD基因中的Mn-SOD基因。通過生物信息學,研究了PtMn-SOD的理化性質和結構特征。PtMn-SOD基因序列可以用于構建重組質粒,轉移到大腸桿菌等目標菌體中表達,為構建產Mn-SOD基因工程菌奠定基礎,從而進一步研究Mn-SOD的理化性質,增加Mn-SOD產量。虎奶菇Mn-SOD的提取鑒定與基因的克隆為Mn-SOD產品的深入開發和利用提供了幫助。