遞推式ARTPUV復合誘變篩選高產β葡萄糖苷酶菌株

夏俊芳,王小靈,古麗娜孜,韓貴林,武 運

(新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052)

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)是從糖苷前體釋放單萜物質的關鍵酶[1]，能夠水解葡萄汁糖苷結合態香氣前體,釋放揮發性糖苷配基,形成濃郁豐富的葡萄酒風味。葡萄酒中的糖苷酶可來源于葡萄果實、酵母菌(釀酒酵母和非釀酒酵母)、乳酸菌及商品化外源性酶制劑[2],早在1989年Laffort等[3]研究發現酵母菌株可以通過水解共軛芳香前體來改善和增強葡萄酒的香氣,但從自然環境分離得到的野生型菌株的產β-葡萄糖苷酶能力有限,已有學者利用紫外誘變、硫酸二乙基酯、亞硝基胍、紫外-亞硝基胍-Co60復合誘變、紫外-甲基磺酸乙酯復合誘變等物理、化學方法篩選得到產β-葡萄糖苷酶的菌株。張莉等[4]通過紫外誘變得到產β-葡萄糖苷酶穩定的突變菌株UV-45,酶活達到75.34 U/mL,較出發菌株提高41.64%;王婧等[5]通過硫酸二乙酯(DES)誘變得到產β-葡萄糖苷酶穩定的突變菌株UV-E-16,酶活達到74.26 U/mL;劉文龍等[6]通過亞硝基胍誘變獲得產β-葡萄糖苷酶的突變株AN-17,酶活達到291 U/mL;陳軍杰等[7]通過紫外-亞硝基胍-Co60復合誘變獲得產β-葡萄糖苷酶的突變菌株N-9,酶活力穩定在8.5 U/mL左右,是原出發菌株的2.1倍;鄭賢金等[8]通過紫外—甲基磺酸乙酯復合誘變獲得產β-葡萄糖苷酶突變菌株TZ-03,酶活達到10.53 IU/mL,是原出發菌株的 1.52倍。但這些常規物理、化學誘變法對操作員的健康和突變效率都存在一定程度上的風險[9]。

近年來,一種新型誘變育種方法——常壓室溫等離子體誘變(ARTP)因其突變速度快、突變體多樣性強、操作簡單安全等特點引起了人們的廣泛關注[10],與其它誘變方法相比,ARTP處理對活細胞的DNA損傷更明顯,突變率更高[11]。ARTP采用99.999%的高純氦氣(He)為出發氣體在高頻電場中產生富含活性的高能粒子,高能粒子作用于整個微生物細胞改變了細胞壁和細胞膜的結構及通透性并造成細胞損傷,生物細胞被迫開啟SOS修復機制,引起基因突變使微生物基因序列及其代謝網絡發生顯著變化,最終獲得大量穩定的突變菌株,ARTP能有效地引起DNA的多樣性損傷,增加誘變突變率且不產生有毒有害物質[12],它已成功地用于細菌[13-14]、酵母菌[5,15]、霉菌[16-17]、食用菌[18-19]等生物育種以提高生物量和代謝產物。僅進行一輪ARTP誘變,不可能獲得理想的突變體,為了獲得預期的目標,可采用遞推式ARTP方法以獲得更多的突變體,Jiang等[20]采用8輪遞推式ARTP誘變提高茂原鏈霉菌產轉谷氨酰胺酶能力;也可采用ARTP與其它誘變方法聯合來提高整體誘變效率,如聯合采用硫酸二乙酯[21]、亞硝基胍[22]、紫外輻射[23]來提高誘變效率。

本研究對前期赤霞珠(Cabernetsauvignon)自然發酵過程中的兩株野生釀酒酵母G13、G21菌株采用遞推式ARTP-UV復合誘變,以β-葡萄糖苷酶活力為主要篩選指標,旨在獲得高產β-葡萄糖苷酶的酵母菌株并為其后續在葡萄酒釀造及提升葡萄酒香氣中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

出發菌株:產β-葡萄糖苷酶優良酵母G13釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、G21釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 新疆農業大學食品科學與藥學學院微生物實驗室;商業酵母D254 煙臺帝伯仕自釀機有限公司;YPD固體培養基:葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、2%瓊脂;YPD液體培養基:葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L 均為北京奧博星責任有限公司;以上培養基均以121 ℃滅菌15 min后備用;初篩培養基:葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、2%瓊脂,滅菌后溫度降至60 ℃加入1 g/L p-NPG;p-NPG(pH5.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配制) 美國Sigma 公司;對硝基苯酚 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

FE20 PLUS pH計 上海梅特勒托利多儀器有限公司;DJ100-3型電子分析天平 上海恒平科學儀器有限公司;DY04-13-44-00壓力蒸汽滅菌器 上海東亞壓力容器制造有限公司;722可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司;THZ-98AB恒溫培養振蕩箱 上海一恒科學儀器有限公司;HSY2-SP電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器廠;HR40-IIAI生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司;ARTP誘變育種儀 無錫源清天木生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子懸液的制備 將保藏的G13、G21菌株接種到斜面中,28 ℃培養48 h,然后將斜面上的菌種接種到100 mL YPD液體培養基中,在28 ℃,200 r/min恒溫振蕩箱中培養18 h,經稀釋倒平板計數,G13菌懸液濃度為3.5×108CFU/mL,G21菌懸液濃度為1.08×108CFU/mL。

1.2.2 生長曲線繪制 將108CFU/mL的G13、G21菌株以5%接種量分別接種到滅菌的含100 mL YPD液體培養基的三角瓶中,于28 ℃,200 r/min搖瓶培養4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60 h后分別在OD600下測吸光值(未接菌的發酵液體培養基作為空白對照),以培養時間為橫坐標,OD值為縱坐標,繪制菌株生長曲線圖。

1.2.3 ARTP誘變 按照ARTP生物誘變儀的操作流程,以高純氦氣為工作氣體,無菌條件吸取10 μL 1.2.1制備的孢子懸液均勻涂布于載片表面,功率為120 W,等離子體的溫度為30 ℃,氣流量為10 SLM,工作距離為2 mm。處理時間分別為30、60、90、120、150、180 s,涂布于YPD平板,28 ℃避光培養48 h,計算不同處理時間的致死率,公式如下:

其中:菌液處理時間0為對照組,稀釋涂布菌落計數為A,菌液處理一定時間為實驗組,稀釋涂布菌落計數為B。

測定突變株酶活,以相對于出發菌株酶活增長20%為正突變,每個處理挑取200株以上突變株測定酶活,以減少酶活測定誤差帶來的正突變率計算誤差,計算誘變正突變率,公式如下:

其中:實驗組菌株產酶活高于出發菌株20%的突變株計數為C。

通過致死率和正突變率來確定G13、G21菌株ARTP誘變最佳處理時間。

1.2.4 紫外誘變(UV) 取1.2.1制備的孢子懸液5 mL于無菌平皿中,紫外(功率15 W,燈距30 cm),照射30、60、90、120、150、180 s。將誘變處理后的孢子懸液適當稀釋涂布于YPD平板,28 ℃避光培養48 h,根據1.2.3計算致死率和正突變率,通過致死率和正突變率來確定G13、G21菌株UV誘變最佳處理時間。

1.2.5 ARTP誘變菌株的篩選 G13菌株經ARTP120 s誘變后,G21菌株經ARTP 90 s誘變后,在平皿上各挑取15個菌落直徑比較大的單菌落,依次編號(如GD13-13表示ARTP誘變120 s的第13號菌株),進行搖瓶發酵,測β-葡萄糖苷酶酶活。

1.2.6 遞推式連續ARTP誘變 選育連續3輪ARTP誘變,選擇β-葡萄糖苷酶產量最高的突變菌株,作為下一輪ARTP誘變的起始菌株。

1.2.7 遞推式ARTP-UV復合誘變 以1.2.6每輪ARTP誘變的最高酶活的突變菌株,作為下一輪UV誘變的起始菌株,進行2輪UV誘變。

1.2.8 產β-葡萄糖苷酶菌株篩選 將誘變后長出的菌落,選擇較大、圓滿、香味濃郁的菌落劃線接種在初篩平板上,28 ℃培養48 h,根據黃色光圈選取單個菌落接種于YPD液體培養基,進行搖瓶發酵,發酵條件為28 ℃、200 r/min,培養48 h后測定酶活,選出高產β-葡萄糖苷酶活菌株。

1.2.9β-葡萄糖苷酶活性的測定 參照侯曉瑞等[24]的方法,對硝基苯酚標準曲線回歸方程為:Y=20.607X+0.0119,決定系數R2=0.9996,吸光度與對硝基苯酚含量成線性關系。吸取0.1 mL粗酶液與0.2 mL 35 mmol/L p-NPG(即以pH=5.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配制而成)混勻,50 ℃保溫10 min,加入2 mL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應并顯色,于400 nm下測定吸光值。以加熱滅活的酶液同樣處理做空白對照并測定吸光值。

酶活力計算公式如下:

式中:U為酶活力單位,U/mL;C為對硝基苯酚(p-NPG)的濃度,μmol/L;V為反應體系的體積,mL;N為原酶液稀釋倍數;t為反應時間,min;0.1為所取上清液或細胞液的體積。

酶活力定義:酶活力單位(U)定義為在pH5.0,50 ℃反應條件下,1 min水解1 nmol p-NPG所需要的酶量。

1.2.10 傳代穩定性試驗 將酶活力高的突變菌株在YPD液體培養基中連續5代培養,培養條件為28 ℃,200 r/min恒溫振蕩箱中培養48 h,按照1.2.9對產β-葡萄糖苷酶活性測定,檢測突變菌株的遺傳穩定性。

1.3 數據處理

所有數據均為3次平行實驗的平均值,數據統計分析采用Statistix 8.1(分析軟件,St Paul,MN)軟件包中Linear Models程序,差異顯著性(P<0.05)分析使用 Tukey HSD程序,采用Excel 2016整理實驗數據,作圖。

2 結果與分析

2.1 G13、G21生長曲線繪制

菌株G13、G21生長曲線如圖1所示,接種4 h內菌體濃度沒有變化,是菌株延滯期;4 h 后G13、G21進入對數生長期,當適應環境后4～24 h菌株進入生長對數期;28 h后,菌體分解代謝與合成代謝的速度基本一致,菌體進入穩定期。由于對數生長期的細胞為生理活性旺盛,突變率高,重現性好,菌體活力旺盛,故后續試驗選擇培養18 h的菌體進行誘變處理。

圖1 菌株G13、G21的生長曲線Fig.1 Growth curve of G13 and G21

2.2 ARTP誘變時間優化

如圖2所示,隨著處理時間的增加,菌體的致死率逐漸增大,菌株G13處理120 s時,G13致死率為92.70%,正突變率達到最大為19%;菌株G21處理90 s時,G21致死率為92.29%,正突變率達到最大為20%;處理150 s時,G13、G21致死率分別達到97.65%、97.20%;處理180 s時,ARTP的致死率分別為98.50%、99.00%,表明ARTP的誘變作用非常劇烈。李小坤等[25]利用常壓室溫等離子體誘變技術選育高核酸釀酒酵母及其特性時,分析致死率90%～95%時突變效應最強,本試驗結合正突變率,G13菌株ARTP誘變最佳處理為120 s,G21菌株ARTP誘變最佳處理為90 s。

圖2 ARTP誘變時間對G13、G21菌株致死率、正突變率的影響Fig.2 Influence of ARTP radiation timeon mortality and mutation rate on G13 and G21

2.3 UV誘變時間優化

由圖3可知,隨著紫外處理時間的增加,菌體的致死率逐漸升高,紫外誘變照射時間不短于10～20 s,不長于10～20 min,菌株G13、G21處理時間90 s時,G13致死率約為91.5%,正突變率達到最大為17%,G21致死率約為90.2%,正突變率達到最大為19%。致死率90%～95%時突變效應最強,結合正突變率,G13、G21菌株UV誘變最佳處理時間均為90 s。

圖3 紫外誘變時間對G13、G21菌株致死率、正突變率的影響Fig.3 Influence of UV radiation timeon mortality and mutation rate on G13 and G21

2.4 ARTP誘變菌株的確定

表1列舉了β-葡萄糖苷酶活性較高的部分代表菌株,經過ARTP誘變所得菌株最高酶活為GD13-09和GD21-12,酶活分別達到156.95、132.72 U/mL是出發菌株G13、G21菌株酶活的3.0和2.7倍,表明通過ARTP誘變獲得的菌株酶活能力明顯高于出發菌株G13、G21。

表1 ARTP誘變菌株的初篩結果(部分代表菌株)Table 1 Preliminary screening results ofARTP mutant strains(Partial representative strains)

2.5 ARTP傳代穩定性試驗結果

GD13-09和GD21-12兩菌株在ARTP傳代中酶活的穩定性結果見表2,同菌株不同傳代次數產酶活力比較,GD13-09和GD21-12菌株前兩代菌株產酶活力穩定性差異不顯著(P>0.05),傳至第三代菌株產酶能力降低,酶活穩定性差異顯著(P<0.05),表明ARTP傳代穩定性不穩定,故后續實驗開展遞推式復合誘變。

表2 ARTP傳代穩定性(酶活，U/mL)Table 2 Stability test of ARTP consecutive generation of two mutant strains(enzyme activity,U/mL)

2.6 遞推式連續ARTP誘變

每輪進入搖瓶復篩的突變株發酵的酶活統計分別如圖4～圖6所示。圖中,最左側的菌株為該輪篩選的出發菌株,即上一輪篩選得到的產β-葡萄糖苷酶酶活最高的菌株。

圖4,第一輪ARTP誘變,G13D1-Dea組的酶活最高,達到了156.95 U/mL;G21D1-Dba組的酶活最高,達到了132.72 U/mL,故選擇G13D1-Dea和G21D1-Dba這兩組菌中的高產菌株作為第二輪ARTP誘變的出發菌株。

圖4 第一輪ARTP誘變篩選菌株發酵酶活統計Fig.4 Statistic results of screeningin ARTP fermentation for the first round

圖5,第二輪ARTP誘變,G13D2-Dka組的酶活最高,達到了187.86 U/mL;G21D2-Dma組的酶活最高,達到了175.24 U/mL,故選擇G13D2-Dka和G21D2-Dma這兩組菌的高產菌株作為第三輪ARTP誘變的出發菌株。

圖5 第二輪ARTP誘變篩選菌株發酵酶活統計Fig.5 Statistic results of screening inARTP fermentation for the second round

圖6,第三輪ARTP誘變,第二輪的起始酶活組G13D3-Dva、G21D3-Dva酶活最高,排除出發菌株酶活,第三輪誘變的最高酶活組是G13D3-Dbb酶活為178.32 U/mL,G21D3-Dwa組酶活為160.62 U/mL。相比前兩輪誘變,第三輪菌株酶活降低,表明連續三輪ARTP誘變突變庫菌株生長變慢,不利于進一步誘變篩選進行,因此結合傳統的紫外誘變方法進行復合處理。

圖6 第三輪ARTP誘變篩選菌株發酵酶活統計Fig.6 Statistic results of screening inARTP fermentation for the third round

2.7 遞推式ARTP-UV復合誘變

第一輪G13菌株ARTP-UV復合誘變的結果如圖7、圖8所示,分別選擇ARTP三輪的高產酶活菌株進行UV誘變90 s,圖7表明,G13復合誘變的高酶活組是Dbb,平均酶活達到了191.52 U/mL;圖8表明,G21復合誘變的高酶活組是Dma,平均酶活達到了176.15 U/mL。

圖7 第一輪G13-ARTP-UV誘變篩選菌株發酵酶活統計Fig.7 Statistic results of G13 screening inARTP-UV fermentation for the first round注:Dea組:G13第一輪ARTP最高酶活菌株組,Dka組:G13第二輪ARTP最高酶活菌株組,Dbb組:G13第三輪ARTP最高酶活菌株組,每組選取4株產酶菌株,圖中不同底紋代表不同菌株;圖9同。

圖8 第一輪G21-ARTP-UV誘變篩選菌株發酵酶活統計Fig.8 Statistic results of G21screening inARTP-UV fermentation for the second round注:Dba組:G21第一輪ARTP最高酶活菌株組,Dma組:G21第二輪ARTP最高酶活菌株組；Dwa組:G21第三輪ARTP最高酶活菌株組,每組選取4株產酶菌株,圖中不同底紋代表不同菌株;圖10同。

第二輪ARTP-UV復合誘變的結果如圖9、圖10所示,第一輪ARTP-UV復合誘變的三組高產酶活組菌株再進行UV誘變90 s,由圖9可知,G13復合誘變的高酶活組是Dea組,平均酶活達到了231.53 U/mL;由圖10可知,G21復合誘變的高酶活組是Dma組,平均酶活達到了177.81 U/mL。對誘變酶活統計,G13、G21最高酶活誘變方式是一輪ARTP誘變兩輪UV誘變,經過遞推式復合誘變,極大地提高了菌株的產酶能力。

表3 ARTP-UV傳代穩定性試驗(酶活，U/mL)Table 3 Stability test of ARTP-UV consecutive generation of two mutant strains(cnzyme activity,U/mL)

圖9 第二輪G13-ARTP-UV誘變篩選菌株發酵酶活統計Fig.9 Statistic results of G13 screening inARTP-UV fermentation for the first round

圖10 第二輪G21-ARTP-UV誘變篩選菌株發酵酶活統計Fig.10 Statistic results of G21 screening inARTP-UV fermentation for the second round

2.8 遞推式復合(ARTP-UV)傳代穩定性分析

由表3,經過5輪傳代ARTP-UV復合誘變篩選的菌株酶活遺傳穩定性差異不顯著(P>0.05),平均酶活分別是出發菌株G13(52.22 U/mL)、G21(48.33 U/mL)的4.61倍和3.59倍。采用遞推式ARTP-UV復合誘變技術作為新型的誘變方法,對產β-葡萄糖苷酶菌株的誘變選育而言,具有良好的突變效果。

3 結論與討論

ARTP誘變技術是一種新型誘變育種技術,具有快速、有效、安全、操作簡便、環境友好、對操作者安全無輻射、正突變率高等優點,已被廣泛用于微生物育種。ARTP可在常壓室溫下均勻產生各種活性粒子,這些活性粒子可以穿透細胞壁和細胞膜,破壞DNA分子,引起突變,從而改變目標微生物的代謝網絡,獲得大容量突變庫[18]。與常規化學誘變相比,ARTP有很強的基因損傷能力,Zhang等[26]以沙門氏菌NM2009為模型菌株,通過ARTP、UV、和化學誘變處理對DNA損傷進行定量評價和比較,發現ARTP對單個活細胞的DNA損傷更大,由于DNA損傷是生物突變的根源[27],因此,ARTP確實能夠作為微生物誘變的有效手段,并在生物誘變育種方面具有廣闊的應用前景。

誘變的方式包括單一誘變劑連續誘變或多種誘變劑交替以及連續誘變,Zou等[11]采用兩輪ARTP誘變紫色白僵菌得到AR01菌株產CoQ10產量比原菌株高25.5%,Luo等[28]采用30輪ARTP誘變得到30000突變體,在500 mL搖瓶和3 L發酵罐中,篩選出H6突變體產丙酮酸產量較原始菌株分別高出32.2%和35.4%。也有很多研究采用多種復合誘變的方法以提高菌株產相應代謝產物含量能力,Li等[21]采用ARTP結合硫酸二乙酯選育出高產花生四烯酸的突變菌株D20,其活力較原始菌株提高了40.61%;Feng等[17]聯合采用微波誘變、紫外線誘變、熱氯化鋰、ARTP 聯合誘變米曲霉KA-11得到高產曲酸的AR-47突變菌株,曲酸含量為96.5 g/L。劉文龍等[29]將ARTP與紫外線復合誘變選育高產酸性蛋白酶黑霉菌株SA-08,其活力較出發菌株提高83.71%;任林英等[30]采用紫外與ARTP復合誘變技術對子囊霉素產生菌吸水鏈霉菌進行誘變處理,其產子囊霉素能力較出發菌株提高4倍以上,發酵單位達568.0 μg/mL;高芳霞等[31]采用ARTP與紫外誘變技術對達托霉素產生菌玫瑰孢鏈霉菌進行復合誘變獲得一株達托霉素產量達到3.9 g/L的突變株Q12-63#,發酵單位較出發菌株提高了37%。Ottenheim C 等[32]也提出由于缺乏比較研究,不能簡單得出結論:遞推式ARTP誘變或者ARTP與傳統誘變方法組合優于單一的ARTP誘變。

本研究將ARTP與UV結合,采用遞推式連續誘變篩選出具有高產β-葡萄糖苷酶的突變株Dea-G13D1Z2和Dma-G21D1Z2,突變菌株在液體發酵培養基中于28 ℃,200 r/min搖床發酵48 h,經過5輪傳代,遺傳穩定性能良好,產β-葡萄糖苷酶平均活性分別為240.93和173.38 U/mL，為出發菌株G13、G21的4.61倍和3.59倍,此酶活力也普遍高于已經報道的釀酒酵母產β-葡萄糖苷酶菌株的酶活[4-5],后續實驗需進一步優化發酵工藝條件,以最大限度地發揮菌株的優良性能,提高產量。