天漿殼生物堿的提取分離純化及對舌癌Tca8113細胞的增殖抑制作用

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(1.錦州醫科大學藥學院,遼寧錦州 121000;2.錦州醫科大學附屬第一醫院,遼寧錦州 121000)

天漿殼是植物蘿藦的果殼。蘿藦Metaplexisjaponica(Thunb.)Makino為蘿藦屬蘿藦科多年生草質纏繞藤本植物,廣泛分布于中國、日本、韓國及俄羅斯。《毛詩草木鳥獸蟲魚疏》中記載古人在食用蘿藦過程中發現了蘿藦的滋補保健作用。王懷隱《太平圣惠方》中記載蘿藦粥,空腹食之具有補腎益精的作用[1-2]。其果殼在中藥中被稱作“天漿殼”,具有補虛助陽,治療咳嗽痰多、肺風痰喘[3-5]等功效。

目前對天漿殼成分的研究主要在多糖、蛋白和多酚方面[6-8]。生物堿因具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等顯著的生物活性成為近年來的研究熱點[9-11]。胡鵬等[12]通過對蘿藦化學成分的研究,確定蘿藦中含有生物堿,孔越等[13]從蘿藦種子中提取出生物堿,但未見有對蘿藦果殼中生物堿進行提取和研究的報道。

國內外普遍采用超聲波輔助醇類溶劑提取法[14]、色譜法[15-16]對生物堿進行提取和分離純化。硅膠柱色譜其性能穩定,操作簡單,適用范圍廣,既可分離極性生物堿,也可分離非極性生物堿[17]。因此本文采用甲醇作為提取劑[18],超聲波輔助提取,硅膠柱色譜法分離純化天漿殼中的生物堿,并探討其對人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞的增殖抑制作用。為天漿殼在食品、藥品方面的開發和進一步的臨床研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

天漿殼 采至遼寧省錦州市周邊地區,經遼寧省錦州市藥品檢驗所翟鐵紅主任藥師鑒定為天漿殼;舌癌Tca8113口腔鱗狀癌細胞株 中科院細胞庫;甲醇、二氯甲烷、鹽酸 分析純,天津永晟精細化工有限公司;氫氧化鈉 分析純,天津市永大化學試劑有限公司;柱層析硅膠100～200目,200～300目 青島海洋化工分廠;TCL預制板F254 煙臺江友硅膠開發有限公司;DMEM培養基、胰酶、PBS、胎牛血清 美國Gibco公司;Hoechst 33342染色液 上海Beyotime公司;Tris 韓國Biosharp公司。

DRX-400 MHz型核磁共振儀 瑞士Bruker公司;P-1020 旋光儀 日本Jasco公司;恒溫水浴鍋 上海騰方公司;DFY-800C型粉碎機 大德藥機公司;旋轉蒸發儀 上海廣英公司;UP3200HE數控超聲波清洗器 南京壘君達超聲電子設備有限公司;SW-CJ-1E潔凈工作臺 上海博迅實業有限公司;LDZM立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;二氧化碳培養箱 Thermo-Fisher公司;XD-101型倒置顯微鏡 日本電子公司;激光共聚焦顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物堿的提取 參考Chen[19]的方法,稍作修改。天漿殼用粉碎機粉碎,過40目篩,稱取2.0 kg天漿殼粉末,88%甲醇浸泡,超聲波功率100 W輔助30 min浸提3次。合并三次浸提液過濾并減壓濃縮。用體積分數為1%的稀鹽酸調濃縮液pH至1,過濾,濾液用飽和NaOH調pH至10,二氯甲烷多次萃取至水層與碘化鉍鉀反應成陰性后合并萃取液,減壓濃縮得天漿殼總生物堿。

1.2.2 生物堿的分離純化 天漿殼總生物堿經硅膠柱(200～300目)柱層析[20],以(二氯甲烷∶乙酸乙酯=10∶1)體系洗脫,得到A部分,以(二氯甲烷∶乙酸乙酯=4∶1)體系洗脫,得到B部分,以(二氯甲烷∶甲醇=20∶1)體系洗脫得到C部分。A部分經柱層析(二氯甲烷∶甲醇=15∶1)再經過(二氯甲烷∶乙酸乙酯=3∶1)純化得到生物堿1;B部分經柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=4∶3)體系純化得到生物堿2；C部分經柱層析二氯甲烷:甲醇系統梯度洗脫(甲醇0%→30%)純化得到生物堿3。

1.2.3 生物堿的結構鑒定 色譜甲醇溶解配制濃度為5 mg/mL生物堿1～3溶液,250 ℃,電子轟擊電離源EI,輔助氣(N2)流量10.0 L/min,噴霧器壓力344.8 kPa,質譜儀檢測生物堿分子質量。

色譜甲醇溶解配制濃度為0.15 g/100 mL生物堿1～3溶液,20 ℃,波長為鈉光D線(589 nm),旋光儀檢測生物堿比旋光度。

色譜氘代氯仿溶解配制濃度為5 mg/mL生物堿1～3溶液,25 ℃,400 MHz,1H NMR位移值以氘代溶劑中殘存的CHCl3(δ7.26)為內標,12C NMR位移值以CHCl3(δ77.0)為內標,譜寬20.55 ppm,延遲時間20 s,采樣時間3.98 s,核磁共振儀檢測生物堿核磁共振譜。

1.2.4 舌癌Tca8113細胞的復蘇 從液氮罐中取凍存的舌癌Tca8113細胞,于37 ℃水浴中快速搖晃解凍,吸取細胞液,置于培養皿中,加入5 mL DMEM完全培養基,輕搖勻使其鋪在培養皿中,在5% CO237 ℃培養箱中培養。

1.2.5 舌癌Tca8113細胞的傳代 培養基中細胞生長覆蓋率至80%～90%時,用移液槍移去培養基中舊培養液,用PBS洗滌3遍,加1 mL胰蛋白酶消化液,顯微鏡下觀察細胞開始變圓時,加入完全培養液終止消化。用移液槍輕輕吹打貼壁細胞,移入離心管中離心(1200 r/min,3 min)后棄去上清液,加入2 mL DMEM完全培養基重懸細胞,每個培養皿中加1 mL細胞懸液和5 mL完全培養基在培養箱中培養。

1.2.6 細胞的計數 按照上述傳代方法制成細胞懸液,取10 μL注入到蓋玻片與計數板的連接處,顯微鏡下觀察并用細胞計數板計數,公式:

細胞密度(個/mL)=(四大格細胞數之和/4)×104

1.2.7 不同濃度生物堿溶液的配制 將3種生物堿用不含血清的DMEM培養液溶解,通過0.22 μm微孔濾膜進行過濾,配制成濃度為(0、10、50、100、150、200 μmol/L)的生物堿溶液[21]。

1.2.8 生物堿對舌癌Tca8113細胞的生長抑制作用 MTT法測定不同濃度生物堿對舌癌Tca8113細胞活力的影響,取對數生長期的細胞制成細胞懸液。將細胞以5×104個/mL的密度接種到96孔板中,在5% CO237 ℃培養箱中培養24 h后,分別用不同濃度(0、10、50、100、150、200 μmol/L)的生物堿1、2、3處理Tca8113細胞。在5% CO237 ℃培養箱中繼續培養48 h后,每孔加入20 μL MTT(0.5 mg/mL)再繼續培養4 h,棄去上清液,每孔加入150 μL DMSO,振蕩1 min,酶標儀在570 nm處測量吸光度值[22]。陰性對照每孔加入等體積的DMEM完全培養液。空白組用來調零,只加培養液不加細胞。

細胞生長抑制率(%)=(陰性對照組OD值-試驗組OD值)/陰性對照組OD值×100

1.2.9 Hoechst 33342細胞染色試驗 為了分析生物堿處理后的舌癌Tca8113細胞形態變化,將細胞以5×104個/mL的密度接種到24孔板中,用不同濃度的生物堿(0、100、150、200 μmol/L)處理24 h。用PBS將細胞洗滌2遍,每次3 min,吸盡液體,0.5 mL Carnoy固定液固定10 min。加入0.5 mL Hoechst 33342染色液,染色5 min。PBS洗滌2遍后用抗淬滅封片液封片,熒光顯微鏡下觀察細胞形態[23]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 化合物的結構解析

圖1 生物堿1的結構Fig.1 Structure of alkaloid 1注:R=OMe。

圖3 生物堿1的13C NMR譜圖Fig.3 The 13C NMR of alkaloid 1

圖4 生物堿2的結構Fig.4 Structure of alkaloid 2

圖5 生物堿2的1H NMR譜圖Fig.5 1H NMR spectra of alkaloid 2

圖6 生物堿2的13C NMR譜圖Fig.6 The 13C NMR of alkaloid 2

表1 三種生物堿對舌癌Tca8113細胞的抑制率Table 1 Inhibition rate of alkaloids of Tca8113 cells

圖7 生物堿3的結構Fig.7 Structure of alkaloid 3注：R1=H,R2=OMe。

圖8 生物堿3的1H NMR譜圖Fig.8 1H NMR spectra of alkaloid 3

圖9 生物堿3的13C NMR譜圖Fig.9 The 13C NMR of alkaloid 3

2.2 天漿殼生物堿對細胞生長的抑制作用結果

為了評定生物堿1、2、3對舌癌Tca8113細胞的生長抑制作用。本試驗選擇MTT初篩法考察它們對細胞的作用。試驗結果由表1所示,經天漿殼生物堿處理后的舌癌Tca8113細胞增殖被抑制,不同濃度生物堿處理后的舌癌細胞OD值較對照組比較為極顯著(P<0.01),抑制率隨著3種生物堿濃度的增加而增加。三種生物堿對舌癌Tca8113細胞的半數抑制率(IC50)分別為157.12、189.22、136.07 μmol/L。

2.3 Hoechst 33342細胞染色試驗結果

Hoechst 33342是一種藍色熒光染料,能少許進入正常細胞膜,使其染上低藍色,而凋亡細胞的膜通透性增強,因而熒光強度比正常細胞要高。為了進一步鑒定天漿殼生物堿對Tca8113細胞的生長抑制作用是否與誘導凋亡有關。對不同濃度的三種生物堿處理后的舌癌Tca8113細胞染色并通過熒光顯微鏡觀察細胞核的形態變化,結果如圖10～圖12所示(附圖均放大200倍)。正常未給藥組細胞內熒光較弱,細胞核形態正常。經不同濃度生物堿1、2、3處理24 h后的部分細胞內熒光變強,形態及細胞核都發生了不同程度的改變,細胞變扁圓,染色質皺縮,細胞核成“新月”狀或碎裂成小圓等特點,且隨著生物堿濃度的增加變化更加明顯,說明其抑制作用具有濃度依賴性。

圖10 不同濃度的生物堿1對舌癌Tca8113細胞形態的影響Fig.10 Effect of different concentrations ofalkaloids 1 on the morphology of Tca8113 cells

圖11 不同濃度的生物堿2對舌癌Tca8113細胞形態的影響Fig.11 Effect of different concentrations ofalkaloids 2 on the morphology of Tca8113 cells

圖12 不同濃度的生物堿3對舌癌Tca8113細胞形態的影響Fig.12 Effect of different concentrations ofalkaloids 3 on the morphology of Tca8113 cells

3 結論

本試驗采用甲醇提取超聲輔助提取法從天漿中提取天漿殼總生物堿并通過硅膠柱色譜法反復分離得到三種生物堿secu’amamine D、securinine、securitinine。MTT細胞活力檢測法觀察不同濃度的三種生物堿對Tca8113細胞的增殖抑制作用,結果顯示,三種生物堿均對舌癌Tca8113細胞的增殖有明顯的抑制作用,且呈濃度依賴性,IC50分別是157.12、189.22、136.07 μmol/L。采用Hoechst 33342染色液檢測三種生物堿處理后的舌癌Tca8113細胞的凋亡情況,結果發現,給藥組細胞發生凋亡,細胞變扁圓,染色質皺縮,細胞核成“新月”狀或碎裂成小圓等特點,且這種凋亡形態呈濃度依賴性,改變隨生物堿濃度的增加而明顯,但具體促使細胞凋亡的機制仍需進一步研究。