TRPC3基因多態性與原發性高血壓患者左心室肥厚的關系

蔣永超，孫曉靖，陳玉嵐△，張俊仕，珠勒皮亞司馬義，徐新娟，張向陽

高血壓可造成心、腦、腎、血管等靶器官損害，其中心臟靶器官損害以左心室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH）最為常見。Framingham 心血管流行病學研究表明，LVH 是可獨立預測心血管發病和死亡風險的指標［1］。研究證實，細胞內鈣信號傳遞途徑是誘導心肌細胞肥大發生、發展最重要的信號轉導通路之一［2］。瞬時受體電位通道C 亞族（transient receptor potential-canonical channel，TRPC）是位于細胞膜上的一類重要陽離子通道，以四聚體形式構成Ca2+內流通道，TRPC3是TRPC家族中具有代表性且非常重要的一個亞群，是TRPC家族中的核心成員，在高血壓心肌肥厚中起關鍵性作用［3］。目前有關高血壓人群TRPC3基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與其LVH的相關性研究報道甚少。本研究以原發性高血壓患者為研究對象，探討TRPC3基因Rs2292232、Rs4995894、Rs4292355這 3 個位點 SNP 與 LVH 的關系，以期為高血壓心臟靶器官損害的早期干預研究提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年3月—2017年12月于新疆醫科大學第一附屬醫院高血壓科住院并確診為原發性高血壓的患者305例，男205例，女100例，平均年齡（45.98±10.37）歲。根據左心室質量指數（left ventricular mass index，LVMI）將患者分為單純高血壓組224 例（對照組，LVMI 男＜115 g/m2、女＜95 g/m2）和高血壓合并 LVH 組 81 例（LVH 組，LVMI 男≥115 g/m2、女≥95 g/m2）。納入標準：（1）原發性高血壓診斷符合《中國高血壓防治指南2018 年修訂版》。（2）年齡18～65歲。（3）均為漢族，且患者之間無一級、二級血緣關系。（4）患者知情同意本研究。排除標準：（1）明確診斷為繼發性高血壓者。（2）伴心臟瓣膜病、先天性心臟病、心肌病、嚴重心律失常等對心臟結構和功能有影響的心臟疾病者。（3）糖尿病、甲狀腺功能亢進或減退等內分泌系統疾病者。（4）嚴重肝腎功能損害、慢性消耗性疾病和惡性腫瘤者。（5）血管緊張素轉換酶抑制劑或者血管緊張素受體Ⅱ拮抗劑服用半年以上者。

1.2 方法

1.2.1 超聲心動圖測定 采用Philips iE33 彩色多普勒超聲診斷儀進行檢測，探頭頻率為5 MHz。由5 年以上心臟超聲工作經驗的技師完成。所有指標均連續檢測3個心動周期取平均值，包括左心室舒張末內徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）、左心室收縮末內徑（left ventricular endsystolic dimension，LVESD）、室間隔厚度（interventricular septal thickness，IVST）及 左 室 后 壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT）等。按Devereux 校正公式計算左心室質量（LVM），LVM（g）=0.8×1.04×［（IVST+LVPWT+LVEDD）3-LVEDD3］+0.6，體表面積計算采用Stevenson 公式，即體表面積（m2）=0.006 1×身高（cm）+0.012 8×體質量（kg）-0.152 9，LVMI（g/m2）=LVM/體表面積。

1.2.2 DNA 提取 患者入院后次日清晨空腹取外周靜脈血5 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中密封，-70 ℃保存。統一采用TIANamp Blood DNA Kit 血液基因組試劑盒（中國天根生化科技有限公司），按照說明書步驟提取基因組DNA，濃度＞0.02 g/L，光密度（OD）260/OD280比值1.8～2.0。

1.2.3TRPC3基因的SNPs 檢測 采用Sequenom MassARRAY?SNP 檢測結合多重PCR 技術、MassARRAYiPLEX 單堿基延伸技術及基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析技術（博奧生物集團有限公司暨生物芯片北京國家工程研究中 心）對TRPC3基 因 SNP 位 點Rs2292232、Rs4995894、Rs4292355進行基因分型檢測。各位點引物序列見表1。根據Hapmap、NCBI-SNP 數據庫選擇位點，按照最小等位基因頻率（Miner Allele Frequency，MAF）＞0.05 且R2＞0.8 篩選出上述 3 個 SNP 位點。PCR 反應體系:10×PCR 反應緩沖液 0.5 μL、25 mmol/L MgCl20.4 μL、25 mmol/L dNTP 0.1 μL，二次蒸餾純凈水1.9 μL，500 nmol/L 引物混合物1.0 μL，5 U/μL Hot-StarTaq 0.1 μL，DNA模板1 μL。擴增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，45個循環；72 ℃ 3 min，4 ℃保持。加入 SAP Mix 反應液 2.0 μL，SAP 處理條件：37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min，4 ℃維持。加入單堿基延伸反應液2 μL，單堿基延伸反應條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，（52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s）×5，40個循環；72 ℃ 3 min，4 ℃維持，運用 MALDI-TOF 質譜儀分析樹脂純化后的擴增產物，檢測結果采用TYPER4.0軟件（sequenom）分型。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析與處理。Hardy-Weinberg 平衡定律驗證樣本的群體代表性。符合正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示，2 組間比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料用中位數和四分位數M（P25，P75）表示，2 組間比較采用Mann-WhitenyU檢驗。計數資料及組間基因型頻率分布比較采用χ2檢驗，Logistic回歸模型分析基因及相關因素與LVH 的關系，P＜0.05 為差異有統計學意義。

Tab.1 Primer sequence of PCR表1 PCR引物序列

2 結果

2.1 一般臨床資料比較 2 組年齡、吸煙史、飲酒史、家族史、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、空腹血糖（FBG）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、24 h平均舒張壓（24 h DBP）差異無統計學意義（P＞0.05），LVH 組較對照組男性比例降低，24 h 平均收縮壓（24 h SBP）、體質量指數（BMI）升高（P＜0.05），見表2。

2.2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗及等位基因分布頻率比較 LVH 組、對照組TRPC3基因 3 個 SNP位點等位基因頻率均處于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態（P＞0.05），樣本具有群體代表性，見表3。2 組TRPC3基因 SNP 位點Rs4995894、Rs4292355基因型和等位基因頻率差異均無統計學意義（P＞0.05）；Rs2292232位點基因型和等位基因頻率差異均有統計學意義（P＜0.05），其中LVH 組較對照組TT 基因型頻率明顯升高（28.40%vs.15.63%，P＜0.05）。

Tab.2 Comparison of general clinical data between LVH group and control group表2 LVH組與對照組一般臨床資料比較

Tab.3 Comparison of H-W genetic balance test and allele frequency between the two groups表3 LVH組與對照組Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗和等位基因頻率比較

2.3 Logistic 回歸分析 以是否為LVH（否=0，是=1）為因變量，性別（女=0，男=1）、BMI、24 h SBP、Rs2292232基因型（GG+GT=0，TT=1）為自變量，進行Logistic 回歸分析顯示，女性、較高24 h SBP、TRPC3基因SNPRs2292232TT基因型為原發性高血壓患者發生LVH的獨立危險因素，見表4。

3 討論

高血壓合并LVH 是機體對血流動力學負荷長期增加的一種適應性反應，高血壓和LVH均是心腦血管疾病的獨立危險因素［4-5］。臨床上，有些高血壓患者雖然持久有效控制了血壓，但心肌肥厚繼續存在，部分高血壓患者甚至在臨床診斷高血壓前就已經出現LVH。高血壓伴LVH 的加權危險會加劇并促進心腦血管疾病的發生發展［6］，而逆轉LVH 可顯著降低心血管病死亡、心肌梗死、腦卒中和心力衰竭等發生的概率［7］。因此，高血壓伴LVH 是一種需早期關注的靶器官損害。近年大量研究表明，心肌細胞內Ca2+濃度升高是引起心肌細胞肥大的最根本原因，是引起初級和次級應答基因變化的始動因素和載體，而且也是心肌肥厚發生、發展的關鍵［8］。TRPC通道是一種主要滲透Ca2+的非電壓門控陽離子通道［9］，在心臟分布廣泛，對心肌肥厚的發生起重要作用［10］；其機制可能是通過調控鈣調節磷酸酶-活化 T 細胞因子（calcineurin-nuclear factor of activated T cells，CaN-NFAT）信號傳導途徑實現［11］。

TRPC通道有7 個亞型（TRPC1～TRPC7），其中人體TRPC2 是偽基因，不表達蛋白。TRPC3 參與心肌肥厚和心肌細胞凋亡2 個過程。Yamaguchi 等［12］發現，TRPC3 參與了體外小鼠心肌細胞應力誘導的Ca2+內流，而在TRPC3基因敲除小鼠中未見這種現象。Shan 等［13］研究表明，在成年小鼠心肌缺血再灌注損傷時，TRPC3的過表達能夠引起心肌細胞凋亡但不參與心肌細胞的壞死。Ma等［14］研究表明，長期高鹽飲食會導致心肌細胞線粒體TRPC3的高表達，增加心肌肥大標志物心鈉肽、腦鈉肽和β-肌球蛋白重鏈的表達，TRPC3的缺失能夠拮抗高鹽飲食誘導的心肌肥大。由此可見，抑制TRPC3將有望成為治療心肌肥厚的潛在新靶點，TRPC3參與高血壓合并LVH 的發生發展過程，但有關TRPC3基因SNP 多態性與高血壓合并LVH之間的關系研究甚少。

本研究基線資料比較結果顯示，女性、24 h SBP增高者及較高BMI更易發生LVH，Logistic 回歸分析校正了多重混雜因素后發現，女性、較高24 h SBP是原發性高血壓患者發生LVH 的危險因素。Gerdts等［15］研究也顯示，女性高血壓患者發生LVH的風險更高。同時本研究結果亦與Framingham 心臟研究結果［16-17］和亞洲高血壓合并左心室肥厚診治專家共識［6］中 展 示 的 結 果 相 近 。 2 組Rs4995894和Rs4292355位點在等位基因頻率、基因型頻率分布差異無統計學意義，Rs2292232位點基因型頻率差異有統計學意義，故推測Rs2292232位點的變異可能是高血壓合并LVH 的遺傳易感因素。Logistic 回歸分析顯示，Rs2292232位點TT 基因型是原發性高血壓患者發生LVH 的獨立危險因素，提示TRPC3基因Rs2292232位點的基因多態性與高血壓合并LVH存在較大關聯。筆者推測TRPC3基因Rs2292232位點的基因多態性對高血壓合并LVH 的影響的可能機制為：（1）TRPC3可能通過調節心肌細胞內Ca2+的濃度變化，使心肌細胞內Ca2+維持高水平狀態，激活CaN-NFAT，造成多種心肌肥厚的相關基因表達，導致心肌細胞體積增大。（2）二酰基甘油通過TRPC3誘導的Ca2+信號通路參與了血管緊張素Ⅱ激活NFAT的過程，從而導致心肌肥厚。（3）TRPC3自身可能直接誘導心肌肥厚。（4）TT 基因型可能影響或改變心肌細胞TRPC3的活性及分布。

綜上所述，TRPC3基因Rs2292232位點 SNP 與原發性高血壓患者發生LVH 有關，其中TT 基因型、女性、較高24 h SBP 為原發性高血壓患者發生LVH的獨立危險因素。臨床工作中需要對高血壓高危人群開展易感基因的早期篩檢，防控危險因素，使臨床治療趨于個體化，以減少靶器官損害、降低心血管風險。