肝臟CD4、CD8及CD68表達與Kasai術后膽管炎的關系研究

葛亮，茍慶云，趙金鳳，高偉，詹江華

膽管炎是膽道閉鎖肝門-空腸吻合術（Kasai術）后最常見且最嚴重的并發癥，發生率高達60%～90%，嚴重影響患兒的自體肝生存時間［1-3］。膽管炎的病理基礎包括膽管的萎縮、消失和壞死，但Kasai術后膽管炎的特征性改變卻鮮有報道。既往研究表明Kasai 術時肝組織的炎癥浸潤程度可以作為預測Kasai 術后膽管炎發生的指標之一［4］；CD8+細胞比例降低，CD4+/CD8+細胞比值升高以及CD68+細胞比例下降，提示患兒預后較差［5］。由于臨床上不主張應用有創性的肝組織活檢來診斷Kasai術后膽管炎，因此目前缺乏膽管炎發作時肝臟組織病理學改變，CD4、CD8 及CD68 表達的研究。本研究擬通過對Kasai術后膽管炎的病理學研究，探討肝臟CD4、CD8及CD68 表達與膽管炎的關系，以期為Kasai 術后膽管炎的診治提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年5月—2018年11月于天津市第一中心醫院完成肝移植手術的膽道閉鎖患兒27 例，其中男12 例，女15 例，年齡4.6～8.2 個月，平均（6.4±1.0）個月。所有患兒既往均于天津市兒童醫院普外科行膽道造影及肝組織活檢確診為膽道閉鎖，并行Kasai術。10例患兒因Kasai術后頻發膽管炎而行肝移植手術（頻發膽管炎組），男6 例，女4例；年齡 4.6～8.2 個月，平均（7.0±1.1）個月。17 例患兒因Kasai 術后黃疸未消退及肝功能衰竭而行肝移植手術，其中既往未發生膽管炎者10例（無膽管炎組），男4例，女6例；年齡4.9～7.8個月，平均（6.1±0.8）個月；既往發生早期膽管炎者7例（早期膽管炎組），男2例，女5例；年齡5.2～6.7個月，平均（6.2±0.6）個月。本研究經天津市兒童醫院及天津市第一中心醫院倫理委員會批準，標本取材經家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 膽管炎診斷標準 排除其他疾病或原因無法解釋的高熱；皮膚鞏膜黃染加重或退后反復出現；大便顏色變淺或再次出現陶土色；血清總膽紅素（total bilirubin，TBil）與直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）升高；血常規提示C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）及中性粒細胞升高［3］。術后1個月內發生的膽管炎為早期膽管炎；術后半年內膽管炎發作次數≥3次為頻發膽管炎。

1.3 方法

1.3.1 資料收集 收集患兒肝移植術前的臨床資料，包括性別、年齡、Kasai手術年齡、自體肝生存時間、肝移植術前白細胞計數（white blood cell，WBC）、CRP、肝移植術前肝功能指標［白 蛋 白（albumin，ALB）、丙 氨 酸 轉 氨 酶（alanine aminotransferas，ALT）、天 冬 氨 酸 轉 氨 酶（aspartate aminotransferase，AST）、DBil、堿 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰轉移酶（γ-glutamyl transferas，GGT）］，以及膽管炎發生情況。

1.3.2 肝組織標本處理 取患兒肝移植時病肝的肝門部肝組織，經10%福爾馬林溶液固定，8～24 h后經石蠟包埋儲存，所有過程均處于同一實驗條件。

1.3.3 HE染色 病理切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水洗，蘇木素浸染5 min，經酸化伊紅乙醇液浸染2 min，梯度乙醇脫水，透明劑浸泡至透明，中性樹膠封片等一系列操作。在光學顯微鏡下觀察肝纖維化、膽管增生、肝組織炎性細胞浸潤程度及膽栓情況等。肝纖維化分級標準（METAVIR 分級標準［6］）：F0，無纖維化；F1，肝匯管區輕度纖維化；F2，鄰近匯管區輕度橋接纖維化；F3，伸向鄰近匯管區重度橋接纖維化；F4，肝硬化、假小葉形成。膽管增生分級標準［7］：0 級，平均每個視野＜5 個增生膽管；1 級，平均每個視野為5～9 個增生膽管；2 級，平均每個視野≥10 個增生膽管；3 級，2 級的基礎上增生膽管形態扭曲異常、細小等表現。炎性細胞浸潤分級標準：計算匯管區炎性細胞數目（N）與細胞核總數（T）的比值（I）；1 級，I＜25%；2 級，25%≤I＜50%；3 級，50%≤I＜75%；4 級，I≥75%。膽栓分級標準［8］：1 級，匯管區無膽栓；2級，僅幾個匯管區的少量膽管有膽栓；3級：每個匯管區的少量膽管存在膽栓；4 級：幾乎所有匯管區的全部小膽管存在膽栓。

1.3.4 免疫組化染色 病理切片脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復15 min，冷卻至室溫，PBS 沖洗5 min×3 次，于3%H2O2中37 ℃孵育10 min，用PBS 沖洗5 min×3 次，滴加一抗（兔抗人CD8 單克隆抗體、小鼠抗人CD4、CD68 單克隆抗體，北京中杉金橋生物技術有限公司），于冰箱中4 ℃過夜，次日取出置于室溫30 min，PBS洗5 min×3次，加二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/鼠IgG聚合物，北京中杉金橋生物技術有限公司）后37 ℃孵育30 min，PBS 洗5 min×3 次，經DAB（試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司）顯色5～10 min，鏡下（×100）觀察染色情況，充分水洗，蘇木素液染核，脫水、透明、中性樹膠封片。免疫組化陽性標準：根據染色強度分為無棕黃色（陰性）、淡棕黃色（弱陽性）、棕黃色（陽性）、棕褐色（強陽性）。切片內讀取任意5 張視野，用同一計算機成像系統留取相同倍數顯微鏡下圖片，采用ImagePro Plus 6.0 自動分析系統（美國 Media Cybernetics 公司）進行半定量分析，計算CD4、CD8、CD68 蛋白的平均光密度（AOD）值。

1.4 統計學方法 數據采用SPSS 20.0 軟件進行統計處理，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。多組間率的比較采用R×C列聯表資料的χ2檢驗，組間多重比較采用Brunden 法進行顯著性水平校正。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組患者一般資料比較 3 組患兒的性別、年齡、Kasai手術年齡及自體肝生存時間差異均無統計學意義，見表1。3 組肝移植術前WBC、CRP 及肝功能指標差異均無統計學意義，見表2。頻發膽管炎組中有4 例患兒入院時存在膽管炎，肝移植前經抗感染及抗炎治療后，體溫恢復正常，CRP降低，其中3例患兒WBC較治療前好轉，而肝功能指標無明顯改善，見表3。

Tab.1 Comparison of general data of children between three groups表1 3組膽道閉鎖患兒一般資料比較

2.2 HE染色結果 3組患兒肝移植時肝纖維化、膽管增生和膽栓分級差異均無統計學意義。頻發膽管炎組肝組織匯管區可見大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，肝竇間隙也可見散在的炎性細胞浸潤；其炎性細胞浸潤程度較無管炎組和早期膽管炎組嚴重，見表4、圖1。

2.3 免疫組化染色結果 CD4 蛋白在匯管區及肝小葉周邊呈陽性表達，呈棕黃色（圖2）；CD8 蛋白主要在匯管區呈強陽性表達，呈棕褐色（圖3）；CD68蛋白在匯管區和肝竇間隙均呈強陽性表達，呈棕褐色（圖4）。3 組間CD4 蛋白的表達水平差異無統計學意義；頻發膽管炎組CD8、CD68 蛋白表達水平均高于無膽管炎組和早期膽管炎組（P＜0.05），見表5。

Tab.2 Comparison of hematological parameters between the three groups of children表2 3組膽道閉鎖患兒血液學指標比較

Tab.3 Changes of hematological parameters before and after treatment in 4 children with cholangitis表3 4例膽管炎患兒治療前后血液學指標改變情況

Tab.4 Comparison of pathological results in each group of children with biliary atresia表4 各組膽道閉鎖患兒病理結果比較

Fig.1 Comparison of inflammatory cell infiltration between the three groups(HE，×100)圖1 3組肝組織標本炎性細胞浸潤程度比較（HE，×100）

Fig.2 The expressions of CD4 in liver tissues of three groups(immunohistochemical staining，×100)圖2 3組肝臟組織標本中CD4的表達情況（免疫組化染色，×100）

Fig.3 The expressions of CD8 in liver tissues of three groups(immunohistochemical staining，×100)圖3 3組肝臟組織標本中CD8的表達情況（免疫組化染色，×100）

Fig.4 The expressions of CD68 in liver tissues of three groups(immunohistochemical staining，×100)圖4 3組肝臟組織標本中CD68的表達情況（免疫組化染色，×100）

Tab.5 Expressions of CD4，CD8 and CD68 proteins in three groups表5 3組膽道閉鎖患兒CD4、CD8及CD68蛋白的表達 （AOD，）

Tab.5 Expressions of CD4，CD8 and CD68 proteins in three groups表5 3組膽道閉鎖患兒CD4、CD8及CD68蛋白的表達 （AOD，）

＊P＜0.05；a與無膽管炎組比較，b與早期膽管炎組比較，P＜0.05

組別無膽管炎組早期膽管炎組頻發膽管炎組F n 10 7 10 CD4 0.099 0±0.016 7 0.104 2±0.022 3 0.114 6±0.014 7 2.028 CD8 0.188 4±0.031 3 0.198 1±0.036 1 0.233 8±0.036 6ab 4.651＊CD68 0.160 7±0.019 0 0.165 4±0.013 3 0.190 2±0.024 0ab 6.151＊

3 討論

Kasai術是目前治療膽道閉鎖的首選治療方式。膽管炎是膽道閉鎖Kasai 術后最常見的并發癥，且Kasai術后一旦發生膽管炎，其反復發作的概率高達90%［9］。反復發作膽管炎將對肝臟造成持續性損害，加速肝硬化過程，導致自體肝生存時間縮短［10-11］。術后膽管炎的防治是保證膽道閉鎖治療成功的關鍵環節。目前膽道閉鎖術后膽管炎的發病機制仍不明確，可能與肝內膽管發育障礙及膽管損傷、腸道微生物遷移、腸道內容物反流及肝門部淋巴回流障礙等因素相關。術后膽管炎的診斷基于患兒的臨床表現及血液學指標檢查，國內尚未見開展肝穿刺活檢病理檢查證實膽管炎發作的研究，且缺乏膽管炎治療效果的評價標準［12］。

有研究顯示，Kasai術可使肝內部分有功能的膽管在一定程度上引流膽汁，緩解肝內膽汁淤積，減輕炎癥反應，進而降低炎癥對膽管的損傷［13］。但膽管炎發作時可導致膽管的萎縮、壞死和消失。免疫細胞在小膽管周圍的浸潤及膽管上皮細胞的壞死可導致部分膽管阻塞。反復發作膽管炎患兒肝內膽管增生嚴重，匯管區膽栓形成，肝細胞可見淤膽，炎性細胞浸潤嚴重［8］。膽管炎發作越頻繁，其肝內炎癥越明顯［14］。本研究行HE 染色示頻發膽管炎組患兒存在嚴重的肝纖維化、膽管增生、膽栓程度及炎性細胞浸潤，與以上研究一致。但肝纖維化、膽管增生及膽栓程度與無膽管炎組和早期膽管炎組無明顯差異，考慮原因是這3種指標均為膽道閉鎖患兒肝臟終末期改變，而并非膽管炎的特征性改變。頻發膽管炎組匯管區炎性細胞浸潤程度明顯高于無膽管炎組和早期膽管炎組，提示匯管區炎性細胞浸潤是膽管炎的特征性表現，其中淋巴細胞浸潤在膽管炎的發作中起重要作用。

有研究表明，免疫系統參與膽道閉鎖的發病，肝內膽管周圍T淋巴細胞浸潤是膽道閉鎖的病理學特征，CD4+和CD8+T細胞是其主要的細胞類型，主要分布于匯管區［15］。CD68 是巨噬細胞/單核細胞的標志，肝臟中的巨噬細胞（即Kupffer細胞）主要存在于肝竇中［16-17］。CD8+T 細胞的特異性免疫反應參與膽管上皮細胞的損傷，在膽道閉鎖肝纖維化中發揮重要作用［18］。研究表明，膽道閉鎖患兒肝組織中均有CD4+、CD8+細胞浸潤，它們不僅可圍繞小膽管周圍形成袖套樣結構，在與匯管區相鄰的肝竇內往往呈團狀聚集現象，鄰近匯管區的肝細胞也有明顯的胞漿疏松化、水腫變性等病理改變。膽道閉鎖患兒肝組織和纖維斑塊存在CD4+、CD8+T淋巴細胞浸潤，手術吻合部位存在炎癥反應，這可能是術后膽管炎的發病基礎［19］。有研究發現Kasai 術時肝組織中CD8+T 細胞浸潤減少是術后膽管炎發生的危險因素，可能與CD8+T 細胞不具有細胞毒性作用但仍存在免疫調節作用有關［20］。本研究結果顯示，頻發膽管炎組CD8、CD68蛋白表達水平均高于無膽管炎組和早期膽管炎組，提示膽管炎發作時炎性細胞種類及數量發生改變，可能與細菌或病毒介導的炎癥反應相關。

膽管炎的主要治療藥物包括抗生素、激素和利膽藥物，臨床上對于膽管炎的治療更多依賴于經驗用藥。患兒體溫恢復正常、黃疸消退、糞便顏色變深等常被視為膽管炎治療有效，但是肝臟的病理改變是否恢復正常卻無從考證。本研究頻發膽管炎組中有4 例患兒入院時就存在膽管炎發作，肝移植前經抗感染及抗炎治療后，血常規中的炎癥指標較前明顯好轉，肝功能變化不顯著，但是肝臟仍然存在嚴重的炎性細胞浸潤，提示膽管炎可成為Kasai術后慢性遷延性疾病，其反復發作加重肝纖維化，導致肝功能衰竭。

肝組織活檢因其有創性在臨床膽管炎診斷及療效評價中的應用受到了很大限制。雖然未能選取膽管炎發作時的肝組織標本是本研究的不足之處，但是因頻發膽管炎而行肝移植患兒的標本能夠部分表現出膽管炎的病理改變，仍具有一定的研究價值。未來期待通過膽管炎的病理改變研究，建立一種簡便、安全、有效的檢查標準來評估膽管炎的預后和轉歸。

綜上所述，Kasai術后膽管炎肝臟病理改變主要為匯管區炎性細胞浸潤，是CD8+T細胞和CD68+肝巨噬細胞參與的炎癥反應。對于反復發作的膽管炎，是否應延長抗感染及抗炎的治療時間有待進一步研究驗證。