MCP-1參與纈沙坦對(duì)阿霉素心臟毒性的預(yù)保護(hù)作用

胡丹，肖何柳 ，于勤

阿霉素（doxorubicin，Dox）屬于蒽環(huán)類藥物，是治療乳腺癌、消化道腫瘤廣譜、有效的一線化療用藥，但存在心臟毒性。研究表明Dox 累積劑量達(dá)400 mg/m2時(shí)，心力衰竭的發(fā)生率約5%，而累積劑量達(dá)550 mg/m2時(shí)，心力衰竭發(fā)生率高達(dá)17%［1］。其機(jī)制主要是由于蒽環(huán)類藥物螯合鐵離子后引起過(guò)氧化氫（H2O2）及超氧陰離子（O2-）的形成，導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)的過(guò)氧化，引起心肌損傷［2］。有研究發(fā)現(xiàn)AT1受 體 阻 滯 劑（angiotensin Ⅱ receptor antagonists，ARBs）纈沙坦對(duì)蒽環(huán)類藥物的心臟毒性具有潛在的保 護(hù) 作用［3］。單核 細(xì) 胞趨化蛋 白 -1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）在心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但相關(guān)信號(hào)通路在其中的作用不清楚。基于此，本研究通過(guò)阿霉素誘導(dǎo)建立SD大鼠心肌損傷模型，探討阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷的免疫與細(xì)胞因子影響機(jī)制，觀察免疫失調(diào)是否參與阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷，并為下一步的預(yù)防與干預(yù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 8 周齡雄性SPF 級(jí) SD 大鼠30 只，體質(zhì)量（180.2±10.3）g，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)于大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院層流級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（室溫21～25 ℃，濕度45%～55%），給予光照14 h，黑夜10 h，固體顆粒飼料喂養(yǎng)。阿霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司），以生理鹽水配制成終濃度為2 g/L的注射液；纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司），以生理鹽水配制成終濃度為10 g/L；氯胺酮（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；5%硫化鈉溶液（成都科龍化工有限公司）；2.5%戊二醛溶液、1%鍔酸溶液（上海生工生物工程股份有限公司）；MCP-1、調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子（RANTES）、次級(jí)淋巴組織趨化因子（6Ckine）蛋白芯片檢測(cè)試劑盒（美國(guó)R&D公司）；MCP-1抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（英國(guó)Abcam 公司）。彩色超聲診斷儀（GE LOGIQ P6）、超聲探頭（GE 11L）、臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Heraeus Biofuge Stratos）；37 ℃恒溫箱、透射電鏡（日本JEDL公司），蛋白電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 30 只大鼠編號(hào)后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組，對(duì)照組（Con 組）、阿霉素組（Dox 組）和纈沙坦+阿霉素組（Val+Dox 組），每組10 只。Dox 組以1.25 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射阿霉素，1 次/周，連續(xù)6 周，生理鹽水（2 mL/kg體質(zhì)量）每天灌胃1次；Val+Dox組：在Dox組給藥基礎(chǔ)上給予纈沙坦溶液（2 mL/kg 體質(zhì)量）灌胃，每周均根據(jù)體質(zhì)量重新調(diào)整藥物；Con組均以生理鹽水灌胃和腹腔注射，給藥劑量同前。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過(guò)（批準(zhǔn)號(hào)：20180926）。

1.2.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能變化 觀察至第10周，氯胺酮（100 mg/kg）腹腔注射麻醉，5%硫化鈉溶液脫毛，固定大鼠。采用GE LOGIQ P6 彩色超聲儀（12.0 MHz 高頻探頭）選擇胸骨左緣左室長(zhǎng)軸切面M 型超聲，測(cè)量左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）及左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF），連續(xù)測(cè)定4個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。

1.2.3 蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)MCP-1、RANTES 及6Ckine 表達(dá) 采集3組大鼠下腔靜脈血2 mL，1 000 r/min離心10 min，分離血清后利用蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)MCP-1、RANTES、6Ckine。從-80 ℃冰箱取出芯片，在室溫下靜置3 h 后編號(hào)。每個(gè)檢測(cè)單元取50～200 μL血清樣品，用2倍體積的U9緩沖液稀釋后上樣；4 ℃孵育過(guò)夜后清洗液洗膜3次；加入芯片二抗室溫避光孵育60 min；清洗液清洗和干燥后，每孔加入1 mL 顯色劑后化學(xué)發(fā)光成像。成像后將對(duì)應(yīng)GAL 文件打開，使芯片圖像與GAL文件的每個(gè)陣列對(duì)齊后讀取并保存數(shù)據(jù)。

1.2.4 電鏡下觀察心肌組織病理變化 第10周處死大鼠后，取心臟，PBS 溶液沖洗3 遍，濾紙吸干稱質(zhì)量，留取大鼠左心室中段心肌組織，切成約1 mm×1 mm×1 mm 組織塊，以2.5%戊二醛溶液固定，置于4 ℃冰箱保存1周，送電鏡室檢測(cè)。左心室心尖及心房組織放入-80 ℃冰箱保存，用于Western blot檢測(cè)。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)MCP-1 蛋白表達(dá) 取適量心肌組織，研磨后加入裂解液制勻漿，置于冰上30 min，將勻漿移至離心管中，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清。BCA 法蛋白定量后利用5%濃縮膠和15%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳（每孔上樣35 μg蛋白）。電泳結(jié)束后恒流150 mA×45 min將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入MCP-1 一抗（1∶1 000）孵育1.5 h，洗膜后再加入稀釋的二抗（1∶3 000）室溫1 h后染色，用相同方法檢測(cè)內(nèi)參GAPDH蛋白表達(dá)，以MCP-1/GAPDH作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠心功能變化 與Con組相比，Dox組和Val+Dox 組 LVEF、LVFS 明顯降低，LVESD、LVEDD明顯升高（P＜0.05）。與 Dox 組相比，Val+Dox 組LVEF、LVFS明顯升高，LVESD、LVEDD明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表1。

Fig.1 Heart echocardiography in three groups of rats圖1 3組大鼠心臟超聲心動(dòng)圖

Tab.1 Comparison of the echocardiographic measurements between three groups of rats表1 3組大鼠心功能指標(biāo)比較 （n=10，）

Tab.1 Comparison of the echocardiographic measurements between three groups of rats表1 3組大鼠心功能指標(biāo)比較 （n=10，）

＊＊P＜0.01；a與Con組比較，b與Dox比較，P＜0.05；表2同

組別Con組Dox組Val+Dox組F LVEF 0.94±0.02 0.65±0.03a 0.78±0.04ab 217.157＊＊LVFS（%）75.75±3.01 42.60±5.95a 53.12±4.58ab 119.003＊＊LVESD（mm）1.19±0.27 3.42±0.54a 3.01±0.37ab 81.064＊＊LVEDD（mm）3.81±0.18 5.36±0.67a 4.91±0.28ab 31.771＊＊

2.2 3 組大鼠血清 MCP-1、RANTES 和 6Ckine 變化 與 Con 組相比，Dox 組 MCP-1、RANTES 表達(dá)升高（P＜0.05），分別上調(diào)約1.87倍、1.40倍和1.26倍；與 Dox 組相比，Val+Dox 組 MCP-1、RANTES、6Ckine表達(dá)顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of the MCP-1,RANTES and 6Ckine expression levels between the three groups表2 3組MCP-1、RANTES和6Ckine表達(dá)水平比較（n=10，）

Tab.2 Comparison of the MCP-1,RANTES and 6Ckine expression levels between the three groups表2 3組MCP-1、RANTES和6Ckine表達(dá)水平比較（n=10，）

組別Con組Dox組Val+Dox組F MCP-1 9 241.49±325.21 17 250.41±265.88a 11 018.54±407.50ab 670.433＊＊RANTES 7 715.50±287.36 10 825.56±286.29a 9 463.56±255.23ab 191.964＊＊6Ckine 11 137.27±417.66 14 105.47±611.16a 11 499.24±385.01b 814.841＊＊

2.3 3 組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化 透射電鏡下Con組大鼠心肌中未見(jiàn)自噬體，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，線粒體基質(zhì)致密，無(wú)水腫；肌原纖維排列整齊均勻，肌節(jié)結(jié)構(gòu)完整。Dox組大鼠心肌可見(jiàn)較豐富的呈現(xiàn)雙層膜的自噬小體（黑色箭頭示），心肌結(jié)構(gòu)模糊，心肌纖維溶解，線粒體豐富但結(jié)構(gòu)顯示不清。Val+Dox 組大鼠心肌組織中的自噬小體減少，肌原纖維結(jié)構(gòu)模糊不清，排列紊亂，與Con 組相比線粒體體積增大、增多，大小不等，但結(jié)構(gòu)完整。見(jiàn)圖2。

2.4 3 組大鼠心肌MCP-1 表達(dá)變化 與Con 組相比，Dox組MCP-1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與Dox組相比，Val+Dox 組MCP-1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

3 討論

Fig.2 Ultrastructure findings of myocardial tissues in three groups of rats(×15 000)圖2 3組大鼠電鏡下心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化（×15 000）

Fig.3 MCP-1 protein expressions in cardiac myocytes of the three groups detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測(cè)3組心肌細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)

Dox 作為臨床上治療惡性腫瘤的一線化療藥物和基礎(chǔ)藥物，因其嚴(yán)重的心臟不良反應(yīng)而應(yīng)用受限［3-5］。臨床上常規(guī)化療劑量可導(dǎo)致不可逆的心肌損害，心血管并發(fā)癥也是目前癌癥患者死亡的主要原因［6-7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ARBs對(duì)蒽環(huán)類藥物化療導(dǎo)致的心臟毒性具有潛在保護(hù)作用，可以逆轉(zhuǎn)心室和血管壁重構(gòu)，促進(jìn)心臟功能恢復(fù)，保護(hù)心肌細(xì)胞［8］。本研究中超聲心動(dòng)圖檢查顯示Dox 組LVEF 及 LVFS 較 Con 組 均 顯 著 降 低 ，LVEDD 及LVESD 均較 Con 組顯著升高，提示 Dox 處理后 SD 大鼠左室收縮功能下降，結(jié)合相應(yīng)電鏡下的心肌改變，表明大鼠心力衰竭模型造模成功。Dox誘導(dǎo)的心肌損傷類似擴(kuò)張型心肌病，導(dǎo)致收縮功能減退。而預(yù)防性應(yīng)用纈沙坦后LVEF、LVFS較Dox組增大，LVEDD及LVESD 較Dox 組減小，表明預(yù)防性纈沙坦干預(yù)可有效減輕左心室收縮功能減退及病理性心室重塑。

心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中，炎性因子的參與發(fā)揮了重要的作用。MCP-1 屬于CC 亞族類炎癥趨化因子家族中的主要成員，其在人體多種組織細(xì)胞中均有表達(dá)。MCP-1 可減少并延遲巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕心臟重塑。有證據(jù)表明，MCP-1的短期表達(dá)可能有益于心臟功能的恢復(fù)［9］。在體外實(shí)驗(yàn)中，MCP-1 可保護(hù)新生小鼠心肌細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的凋亡［10］；相反，過(guò)表達(dá)MCP-1的轉(zhuǎn)基因小鼠慢性炎癥可引起MCP-1 的持續(xù)高表達(dá)。隨著模型動(dòng)物的衰老，MCP-1升高水平更加明顯，左室質(zhì)量和心室功能障礙加重［11］。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MCP-1 在低劑量，短時(shí)間干預(yù)情況下可以在心臟修復(fù)中表現(xiàn)出保護(hù)性，但這種保護(hù)作用可能是由于MCP-1 誘導(dǎo)了保護(hù)性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激伴侶的產(chǎn)生［12］，長(zhǎng)期暴露于 MCP-1 引起的持續(xù) ER 應(yīng)激下，保護(hù)作用會(huì)減弱，導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)Dox 誘導(dǎo)的大鼠血清中MCP-1 蛋白顯著升高，大于蛋白組學(xué)公認(rèn)的1.5 倍表達(dá)差異標(biāo)準(zhǔn)值［13］，而RANTES、6Ckine 未達(dá)1.5倍標(biāo)準(zhǔn)值。進(jìn)一步檢測(cè)心肌中MCP-1 蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)與血清檢測(cè)結(jié)果一致，提示MCP-1 廣泛參與了Dox 誘導(dǎo)大鼠的心肌毒性。本實(shí)驗(yàn)中，Val+Dox 組 MCP-1 表達(dá)較 Dox 組顯著減少。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)Dox 可使大鼠體內(nèi)血管緊張素（Ang）Ⅱ顯著增加［14］。此外，體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)顯示，AngⅡ可誘導(dǎo)MCP-1 表達(dá)增加［15］。由于纈沙坦能選擇性作用于心臟AT1受體，使AngⅡ表達(dá)減少，筆者推測(cè)纈沙坦可能通過(guò)抑制Dox 誘導(dǎo)的AngⅡ升高所引起的MCP-1 表達(dá)增加，進(jìn)而減輕Dox的心臟毒性。

綜上所示，本研究從心臟超聲結(jié)構(gòu)、心肌超微結(jié)構(gòu)和MCP-1的表達(dá)變化等方面觀察了Dox誘導(dǎo)心肌損傷的病理生理改變。纈沙坦可以減少心肌MCP-1 炎性因子的表達(dá)，從而預(yù)防性保護(hù)阿霉素所致心肌損傷，提示免疫失調(diào)可能參與阿霉素心肌毒性作用，本研究進(jìn)一步為纈沙坦減輕阿霉素心肌損傷提供了潛在機(jī)制和解釋。