BNIP3介導的線粒體自噬對低氧環境下卵巢癌HO-8910PM細胞侵襲轉移的影響

陳國慶，葉萍，徐玲，謝曉英△

線粒體是細胞產生腺苷三磷酸（ATP）以維持生命活動的重要細胞器，在低氧條件下，線粒體內產生大量活性氧（ROS），誘發強烈的氧化應激反應而導致缺氧性細胞損傷［1］。卵巢癌細胞由于生長迅速、代謝活躍、耗氧量大而常處于低氧環境中。然而卵巢癌細胞線粒體結構完整、數量豐富，極少出現缺氧性細胞損傷，其抗缺氧損傷機制暫未完全闡明。線粒體自噬是在低氧等不良環境下細胞自我吞噬、清除受損線粒體以維持內環境穩態的重要調節機制。筆者前期研究已證實卵巢癌細胞自噬與增殖的關系［2］，然而有關線粒體自噬與卵巢癌轉移的關系報道罕見。B 淋巴細胞瘤-2 基因/腺病毒E1B 相互作用蛋白3（BNIP3）是定位于線粒體外膜的蛋白，在特定條件下與自噬微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）介導自噬從而清除受損線粒體［3］。卵巢癌細胞是否通過BNIP3調控線粒體自噬來維持在低氧條件下繼續向遠處轉移目前尚未明確。本研究將模擬卵巢癌體內低氧環境，應用人高轉移性卵巢癌細胞株HO-8910PM 制作體外低氧細胞模型，分析低氧條件下BNIP3 的表達變化，以及該條件下抑制BNIP3 表達對細胞線粒體自噬的影響，并分析細胞侵襲轉移功能的變化，為進一步明確卵巢癌可能的轉移機制提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑及設備 人高轉移性卵巢癌細胞系HO-8910PM 由重慶醫科大學病理生理教研室贈與。DMEM細胞培養基、胎牛血清、胰蛋白酶等購自南京沃利爾斯生物技術有限公司；BNIP3 siRNA 由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成；Transwell小室購自Corning公司；BNIP3及LC3-Ⅱ單克隆抗體（一抗）購自深圳市牛啟生物技術有限公司；實時熒光定量PCR（qPCR）及Western blot實驗等相關試劑盒購自賽恩斯（深圳）生命科學有限公司。H-7500 型透射電鏡購自日本HITACHI公司；PCR儀、化學顯像儀等購自美國Bio-Rad。

1.2 低氧模型設計與實驗分組 取生長對數期HO-8910PM細胞應用于相關實驗。實驗共分為3組：常氧組、低氧組、低氧+BNIP3 siRNA組，其中常氧組氣體條件為20%O2、5%CO2、75%N2；而低氧組、低氧+BNIP3 siRNA 組的氣體條件為2%O2、5%CO2、93%N2。上述各組細胞先按常規環境孵育12 h，待細胞進入生長對數期且密度在60%～80%時，參照不同氣體條件分組處理48 h，每組均為5個樣本。

1.3 BNIP3 siRNA 轉染 應用胰蛋白酶將生長對數期HO-8910PM 細胞消化并制作細胞懸液，將細胞懸接種在6 孔板上，并使每孔細胞為1.0×105個。常規培養12 h 待細胞貼壁后，在低氧+BNIP3 siRNA 組加入終濃度為5 nmol/L 的BNIP3 siRNA 并放置于低氧條件進行轉染，處理48 h 進行后續實驗。

1.4 吖啶橙染色分析線粒體自噬情況 各組細胞在培養結束前10 min 加入終濃度為1 mg/L 的吖啶橙染液進行活體染色，后去除含吖啶橙的培養液，并應用無菌PBS 液反復清洗細胞，最后應用熒光顯微鏡觀察細胞染色情況。線粒體自噬小體為酸性小體，將被吖啶橙染為紅色，而未發生線粒體自噬的細胞漿，將呈現綠色熒光。在400 倍鏡下計數500 個細胞，計算陽性細胞所占比率作為細胞自噬率。

1.5 透射電鏡觀察細胞線粒體自噬小體 各組細胞經處理后在2.5%的戊二醛溶液中低溫固定12 h，應用1%鋨酸再次固定，經乙醇與丙酮梯度脫水、環氧樹脂618浸透、包埋等步驟后，制成70 nm超薄切片，使用枸櫞酸鉛和醋酸鈾進行電子染色。將切片置于透射電鏡下，觀察各組細胞形態結構的變化，重點觀察線粒體自噬小體的產生情況，以及其他超微結構的改變，并將發現3個以上線粒體自噬小體的細胞視為陽性細胞，隨機觀察100個細胞，計數細胞自噬體發生率。

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移率 應用生長對數期HO-8910PM細胞制作細胞懸液，調整細胞濃度為5×105個/mL，將細胞接種于6孔板內，常規培養24 h后在培養板底部劃痕，并應用無菌PBS將劃痕脫落的懸空細胞除去后進行分組處理。分別置于常氧和低氧條件下孵育48 h后，于顯微鏡下觀察劃痕部位的細胞分布情況，并計數細胞遷移率：低氧組（或BNIP3 siRNA+低氧組）遷移細胞數/常氧組遷移細胞數×100%。

1.7 Transwell 小室檢測細胞侵襲率 取出Transwell 小室，置于4 ℃預冷，按1∶8比例用PBS緩沖液配制Matrigel膠工作液，取此工作液100 μL從小室內壁緩慢注入完成鋪膠，37 ℃條件下放置30 min備用。取24孔板并向其注入包含10%胎牛血清的細胞培養液600 μL/孔，將小室放置于24孔板中，向小室加入細胞濃度為2×106個/mL 的細胞懸液各100 μL。按常氧及低氧條件培養48 h，后經去除上室未穿膜細胞、固定、伊紅染色。在200 倍光鏡下，隨機讀取10 個視野，計數膜背側的穿膜數，并計算侵襲率：低氧組（或BNIP3 siRNA+低氧組）穿膜細胞數/常氧組穿膜細胞數×100%。

1.8 qPCR檢測BNIP3及LC3-Ⅱ的基因表達 應用Trizol試劑提取已經處理48 h 的細胞總RNA，對總RNA 進行定量分析并逆轉錄成cDNA，以β-actin作為內參基因，分別檢測BNIP3及LC3-ⅡmRNA 的表達量。按下述體系進行qPCR：SYBR Premix EX TaqTMⅡ 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板cDNA 2 μL，后應用無菌雙蒸水補足至25 μL。PCR 反應條件為95 ℃預變性10 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共計循環40 次，引物序列見表1，BNIP3及LC3-Ⅱ相對表達量以 2-ΔΔCt法計算。

1.9 Western blot 檢測BNIP3 及LC3-Ⅱ的蛋白表達 消化、收集3 組經處理的HO-8910PM 細胞，按照Western blot 試劑盒進行操作，首先加入細胞裂解液處理細胞，提取總蛋白后采用BCA 法進行蛋白定量，后經下述步驟進行Western blot：SDS-PAGE、轉膜、封閉抗體，清洗后加入一抗（抗BNIP3 和LC3-Ⅱ），放置4 ℃冰箱過夜，清洗后加入二抗，37 ℃反應1 h，再經化學顯色，最后將反應膜放入成像儀中分析，用Quantity one軟件分析BNIP3和LC3-Ⅱ蛋白的相對表達量。

Tab.1 Primer sequence of qPCR表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.10 統計學方法 應用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 低氧及轉染BNIP3 siRNA 對HO-8910PM 細胞線粒體自噬的影響 吖啶橙染色結果顯示，在低氧條件下，卵巢癌HO-8910PM細胞線粒體自噬率顯著增加，在低氧基礎上聯合轉染BNIP3 siRNA 可明顯抑制線粒體自噬（均P＜0.01），見表2、圖1。透射電鏡結果顯示，在低氧環境下，HO-8910PM 細胞胞漿內雙膜結構的線粒體自噬小體顯著增多，低氧聯合轉染BNIP3 siRNA 細胞可見大量線粒體腫脹、崩裂現象，而線粒體自噬小體明顯減少（均P＜0.01）。見表2、圖2。

Fig.1 Mitophagy of HO-8910PM cells stained with acridine orange in three groups(×400)圖1 HO-8910PM細胞經處理后吖啶橙染色線粒體自噬發生情況（×400）

Fig.2 Mitophagy in HO-8910PM cells under TEM in three groups(×10 000)圖2 HO-8910PM細胞經處理后透射電鏡下線粒體自噬發生情況（×10 000）

Fig.3 Migration ability of HO-8910PM cells under different treatment factors in three groups(×200)圖3 HO-8910PM細胞不同處理因素下遷移能力情況（×200）

Fig.4 Changes of invasion ability of HO-8910PM cells under different conditions in three groups(×200)圖4 不同條件下HO-8910PM細胞侵襲能力變化（×200）

Tab.2 Effects of hypoxia and BNIP3 siRNA on mitophagy rate of HO-8910PM cells表2 低氧及轉染BNIP3 siRNA對HO-8910PM細胞線粒體自噬率的影響 （n=5，%，）

Tab.2 Effects of hypoxia and BNIP3 siRNA on mitophagy rate of HO-8910PM cells表2 低氧及轉染BNIP3 siRNA對HO-8910PM細胞線粒體自噬率的影響 （n=5，%，）

＊＊P＜0.01；a與常氧組比較，b與低氧組比較，P＜0.05

組別常氧組低氧組低氧+BNIP3 siRNA組F細胞自噬率4.31±0.88 35.12±5.99a 4.74±0.94b 124.512＊＊自噬體發生率3.13±0.46 28.61±4.49a 3.00±0.29b 159.821＊＊

2.2 低氧及轉染BNIP3 siRNA 對HO-8910PM 細胞遷移能力的影響 低氧條件下細胞遷移率與常氧條件下差異無統計學意義（96.39%±1.25%vs.100%），而低氧+BNIP3 siRNA 組（27.69%±5.33%）細胞遷移率較低氧組降低（n=5，F=831.061，P＜0.01），見圖3。

2.3 低氧及轉染BNIP3 siRNA 對HO-8910PM 細胞侵襲能力的影響 低氧條件下，Transwell 小室穿膜細胞數與常氧條件下差異無統計學意義（99.73%±9.69%vs.100%），而低氧+BNIP3 siRNA 組（19.90%±3.25%）較低氧組細胞侵襲率顯著降低（n=5，F=306.158，P＜0.01），見圖4。

2.4 低氧及轉染BNIP3 siRNA 對BNIP3、LC3-Ⅱ基因表達的影響 低氧組卵巢癌HO-8910PM 細胞BNIP3、LC3-Ⅱ的基因表達量較常氧組顯著升高（P＜0.05），而在低氧條件下轉染BNIP3 siRNA 后細胞BNIP3、LC3-Ⅱ的基因表達量顯著下降（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Effects of BNIP3 siRNA transfection on the expressions of related genes and proteins in HO-8910PM cells under hypoxia and hypoxia conditions表3 低氧及低氧條件下轉染BNIP3 siRNA對HO-8910PM細胞相關基因及蛋白表達的影響（n=5，）

Tab.3 Effects of BNIP3 siRNA transfection on the expressions of related genes and proteins in HO-8910PM cells under hypoxia and hypoxia conditions表3 低氧及低氧條件下轉染BNIP3 siRNA對HO-8910PM細胞相關基因及蛋白表達的影響（n=5，）

＊＊P＜0.01；a與常氧組比較，b與低氧組比較，P＜0.05

組別常氧組低氧組低氧+BNIP3 siRNA組F mRNA相對表達量BNIP3 1.00±0.00 2.28±0.11a 0.84±0.16ab LC3-Ⅱ1.00±0.00 3.67±0.73a 0.71±0.14b蛋白相對表達量BNIP3 0.33±0.06 0.93±0.06a 0.31±0.06b LC3-Ⅱ0.37±0.05 0.91±0.06a 0.27±0.07ab 263.973＊＊72.141＊＊169.800＊＊146.944＊＊

2.5 低氧及轉染BNIP3 siRNA 對BNIP3、LC3-Ⅱ蛋白表達的影響 低氧組卵巢癌HO-8910PM 細胞BNIP3、LC3-Ⅱ的蛋白表達量較常氧組顯著升高（P＜0.05），而在低氧條件下轉染BNIP3 siRNA 后細胞BNIP3、LC3-Ⅱ的蛋白表達量顯著下降（P＜0.05），見表3、圖5。

Fig.5 Expressions of BNIP3 and LC3-Ⅱin HO-8910PM cells under different conditions圖5 不同條件下HO-8910PM細胞BNIP3及LC3-Ⅱ表達變化

3 討論

3.1 轉移是導致卵巢癌患者5年生存率低的重要原因 由于卵巢位于盆腔深處，在本病確診時大多已處于中晚期，因而常伴癌細胞廣泛轉移，導致卵巢癌的死亡率居高難下，因此抑制轉移是治療卵巢癌亟待解決的重要問題［4］。探明卵巢癌轉移的通路和分子機制是制定抑制轉移治療方案的根本途徑。目前有關卵巢癌細胞轉移的機制仍集中于細胞在離巢后釋放大量促進血管生長的因子，為新發癌灶提供血液營養，并最終形成轉移灶［5-7］。然而，卵巢癌在脫離了原發灶向遠處游出時失去母瘤血供，導致細胞處于缺血、缺營養的微環境，在新生血管形成前卵巢癌細胞通過何種機制避免凋亡而繼續生存的機制仍不清楚。

3.2 線粒體自噬是低氧條件下卵巢癌細胞自我保護的重要機制 線粒體是細胞氧化供能的重要場所，在缺氧條件下，線粒體氧化反應障礙可生成大量ROS而受損，同時發生線粒體膜電位變化，導致膜內外線粒體電解質濃度差異常，抑制了相關酶活性，進一步加重線粒體功能障礙，如受損線粒體不及時清除，會將大量ROS等釋放至細胞質中，最終導致細胞死亡［8］。線粒體自噬是細胞在缺氧等不利環境下自我吞噬清除線粒體、維持細胞繼續生存的生物學現象［9-10］。筆者推測卵巢癌細胞在脫離母瘤后處于低氧環境，細胞啟動線粒體自噬，及時清除了受損線粒體，避免了出現缺氧性細胞損傷，在癌細胞生成新轉移灶、得到新的血供之前發揮了關鍵作用。

BNIP3 是一種線粒體外膜蛋白，可與LC3 等自噬蛋白結合，介導形成自噬小體并消化線粒體［11］。本研究證實，卵巢癌HO-8910PM 細胞在低氧條件下，線粒體外膜蛋白BNIP3表達量顯著增加，與常氧條件下的細胞相比其mRNA 的表達量明顯增加，而經過翻譯最終成熟BNIP3蛋白相應增加。形態學分析可見，低氧條件下細胞線粒體自噬活性顯著增加。在吖啶橙染色后觀察到細胞質出現大量的紅色嗜酸性染色區域，而透射電鏡更為直觀地證實了這一結果。在透射電鏡下，低氧條件的HO-8910PM細胞自噬活性明顯增強，胞漿處易見被雙膜結構包裹的線粒體自噬小體，其中線粒體可見形態異常、腫脹等變化，而自噬體外的線粒體大多完好無損。本研究證實，在低氧條件下HO-8910PM 細胞LC3-Ⅱ表達量顯著增高，上述結果均提示，低氧條件下細胞啟動線粒體自噬，清除受損的線粒體，這與其他種類細胞在低氧時表達增加的報道一致［12-13］。本研究結果證實，抑制BNIP3 的表達可顯著抑制低氧環境時的線粒體自噬發生率。透射電鏡觀察到抑制BNIP3的表達后線粒體自噬小體顯著減少，同時細胞出現典型的缺氧性細胞損傷的超微結構變化，即線粒體腫脹、崩裂、溶解等，正常形態的線粒體少見，并可伴細胞凋亡小體出現。qPCR 及Western blot 實驗也證實，抑制BNIP3 的表達后LC3-Ⅱ表達量也隨之明顯下降。

3.3 BNIP3 表達增加促進線粒體自噬 本研究顯示，HO-8910PM 細胞在低氧條件下，通過增加BNIP3 表達啟動線粒體自噬并保護細胞，以維持細胞具有正常的遷移及侵襲能力，因此筆者推測BNIP3是卵巢癌轉移的重要靶點。癌細胞通過基質黏附、運動緩慢向遠處游走、轉移［14］，在此過程中必須提供大量ATP為黏附、運動供能，并保障細胞內正常氧化反應的進行，一旦線粒體功能受損，則出現供能不足，其轉移功能受抑。抑制BNIP3 可顯著抑制細胞轉移，但并不能完全阻止其轉移，這提示卵巢癌細胞還有其他途徑和機制進行離巢后生存和轉移。已有研究證實，高轉移性卵巢癌可表達整合素α5（integrin α5，TGA5），易通過與瘤體組織中腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）結合，形成細胞球并組成卵巢癌轉移單元（metastatic units，MUs），成纖維細胞能夠促進腹水中卵巢癌細胞的存活，并協助發生腹膜浸潤［15］。

總之，本研究初步證實卵巢癌HO-8910PM細胞在低氧條件下通過增加線粒體膜蛋白BNIP3的表達啟動線粒體自噬清除受損線粒體，實現細胞自我保護機制。在低氧條件下，抑制BNIP3表達時，線粒體自噬顯著受抑，細胞自我保護功能被破壞，出現典型的缺氧性細胞損傷變化，細胞遷移和侵襲功能均受到明顯抑制，因此推測BNIP3 是卵巢癌轉移的重要靶點。由于線粒體自噬及卵巢癌轉移的調控機制均為眾多分子參與的多通路網絡調控，BNIP3 在卵巢癌轉移中的詳盡機制仍待進一步探索。