基于轉錄組測序的EV71感染RD細胞的基因表達變化研究

程凱，曹麗，張鑫艷，郝晉芳，張曉延

腸道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）是一種單股正鏈小RNA 病毒，5 歲以下兒童感染后可以出現手足口?。╤and-foot-mouth disease，HFMD）［1］。該病癥狀主要有發熱、手足口皰疹，少數患兒會出現中樞神經系統癥狀，如腦膜炎、腦炎、急性弛緩性肌無力、脊髓灰質炎、肺水腫等臨床表現，甚至出現死亡［2］。HFMD 通常在每年夏季發生，且近些年冬春季發病率也明顯上升，2008 年被列為國家法定傳染?。?］。目前國內外學者從細胞凋亡［4］、自噬［5］、焦亡［6］等方面對EV71誘發HFMD的分子機制進行了研究，但確切致病機制尚不明確。本課題組前期研究已經證實EV71 可以引起人橫紋肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RD）細胞和人胃黏膜上皮細胞系GES-1發生自噬和凋亡［5，7］，但是這些變化的發生時間及影響因素尚缺乏明顯的證據。本實驗擬探究EV71 感染細胞后自噬和免疫應答相關基因表達發生改變的時間和具體靶點，以期為HFMD的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和病毒株 RD 細胞株購于中國科學院細胞庫，EV71 型病毒株由北京協和醫學院病原生物學研究所趙振東教授課題組惠贈。

1.1.2 試劑及儀器 DMEM高糖培養基、胰酶、胎牛血清、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，兔源一抗微管相關蛋白1 輕鏈3（LC-3）、自噬相關基因5（Atg5）、病毒衣殼蛋白1（VP-1）購自CST公司，鼠源一抗雷帕霉素不敏感的mTOR伴侶蛋白（Rictor）購自GeneTex公司，兔源一抗β-actin 購自沈陽萬類生物科技有限公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAG）配制試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，總RNA 提取試劑（TRIzol）購自Invitrogen公司，其他試劑均選自國內公司的分析純。3111型CO2恒溫培養箱購自美國Thermo Fisher 公司，Eon 微孔板酶標儀購自美國BioTek 公司，DMI3000B 倒置熒光顯微鏡購自德國Leica 公司，垂直電泳儀、電轉儀、Universal Hood Ⅲ凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 RD 細胞培養于DMEM 高糖培養基（含10%胎牛血清，100 mg/L 鏈霉素和100 U/mL 青霉素）中，37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中，每2 d 細胞換液1 次，長滿培養皿后傳代。

1.2.2 病毒擴增 RD細胞培養至匯合度約90%，提前1 h換液，-80 ℃冰箱取出EV71病毒液，按1∶5加入細胞培養液中，十字混勻，37 ℃、5%CO2培養箱培養24 h。倒置顯微鏡下觀察染毒細胞全部死亡后，收集上清于15 mL 離心管，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，上清分裝標記并凍存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 病毒滴度測定 取生長狀態良好的RD細胞，計數，接種至 96 孔板，每孔100 μL，含 5 000 個細胞。按10 倍倍比稀釋病毒，每個濃度加1列，共11列，第12列加等量培養基作陰性對照。培養48 h后標記50%以上細胞致死的孔，按公式計算半數組織培養感染劑量（50%tissue culture infective dose，TCID50），按照卡波公式計算并換算感染復數（multiplicity of infection，MOI）。

1.2.4 不同時間和劑量病毒對細胞的作用 RD細胞接種至6 孔板，按 MOI=10、MOI=1、MOI=0.1 給各孔加病毒液，培養12 h 后收集細胞，提取總蛋白。通過蛋白免疫印跡（Western blot）技術觀察VP-1 的表達量，并分析篩選合適的MOI。根據篩選結果以MOI=1 感染細胞，選擇0、0.5、1、1.5、3、6、9、12 h共8組，倒置顯微鏡觀察細胞形態和數量變化。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達 收集各組細胞，加入含苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的蛋白裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心15 min，BCA試劑盒測總蛋白質濃度。SDS-PAGE分離蛋白約2 h，轉硝酸纖維素（NC）膜1 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗孵育4 ℃過夜。次日清洗3 次，用HRP 標記的二抗孵育2 h，加底物顯色，凝膠成像系統掃描并分析結果。

1.2.6 總mRNA提取及測序 同1.2.4處理并收集細胞，分別加TRIzol，吹打均勻，經干冰運輸至華大基因公司武漢公司進行轉錄組測序。提取出的RNA 經檢測合格后，反轉錄成cDNA。末端連接接頭，進行PCR 擴增，產物熱變性成單鏈，建立單鏈環狀DNA文庫，CG測序儀測序。

1.2.7 高內涵細胞成像檢測相關蛋白表達 提前1 d細胞換液并計數，將RD 細胞接種至96 孔板，每組設3 個復孔，按照MOI=1 選擇不同時間進行干預。干預后吸凈培養基，4%多聚甲醛固定30 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后用0.5%Triton-X100室溫通透20 min，山羊血清封閉30 min。根據測序結果各孔按1∶5 000濃度比加適量Atg5、Rictor抗體，4 ℃過夜。次日PBS清洗后加熒光二抗，室溫避光孵育1 h，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復染細胞核10 min，PBS 清洗后上機檢測。

1.3 統計學方法 測序數據運用GO、KEGG 等軟件進行分析，其他數據采用SPSS 22.0 軟件進行分析。計量資料用均數±標準差（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EV71 感染對RD 細胞形態和功能變化的影響 倒置顯微鏡明場觀察可見，培養中的RD細胞在接觸EV71后0.5 h即可出現明顯的空斑，3 h細胞由梭形貼壁生長逐漸變為圓形懸浮，與0 h組相比細胞數量明顯減少（F=193.330，P＜0.05）。9 h 圓形細胞約占總數的50%，12 h約占70%，提示病毒已經開始大量繁殖和釋放，細胞死亡；而正常培養細胞生長狀態良好，仍然維持梭形貼壁生長。見圖1。

2.2 不同劑量和時間EV71 感染RD 細胞對蛋白表達的影響 EV71 感染RD 細胞12 h 后，病毒已經在細胞內有所復制，VP-1 表達量隨MOI 增加而升高（F=7.133，P＜0.05），見圖2A、B。MOI=1 時已經可以看到明顯的VP-1 條帶，因此后續實驗全部選擇MOI=1進行細胞感染。在MOI=1時病毒感染后6 h、9 h、12 h，病毒在RD 細胞內已經開始表達VP-1，細胞內已經合成新的病毒，但3個時點間VP-1的表達量差異無統計學意義（F=0.201，P＞0.05），見圖2C、D；而細胞自噬相關蛋白LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ的變化出現在感染后9 h，高于0 h 組（F=12.005，P＜0.01），見圖2E、F。

Fig.1 Morphological and quantitative changes of RD cells infected with EV71 at different time points圖1 不同時間EV71感染RD細胞形態和數量變化

Fig.2 Effects of different doses and time points of EV71 on protein expression in RD cells圖2 不同劑量和時間EV71對RD細胞蛋白表達的影響

2.3 EV71 感染RD 細胞對基因表達的影響 轉錄組測序結果顯示，EV71 感染RD 細胞后0.5 h，細胞內上調基因294 個，下調基因34 個（圖3A），感染后1 h 上調基因 29 個，下調基因 52 個（圖 3B），1.5 h 上調基因707 個，下調基因 72 個（圖 3C）?；虮磉_變化峰值出現在感染后3 h（圖3D），上調基因1 199 個，下調基因126 個。在感染后6 h、9 h、12 h 基因表達變化略有下降，分別上調基因403、747、758 個，下調基因472、184、169 個（圖3E～G）。感染病毒0.5 h 后已經有病毒侵入細胞，而3 h 病毒已經開始通過影響細胞基因表達而啟動病毒復制。

2.4 EV71 感染RD 細胞對信號通路分子的影響 通過GO 富集和KEGG 信號通路分析發現，在EV71 感染RD 細胞3 h，細胞信號通路基因有216個發生變化（綠色），其中100 多個信號分子均參與細胞的自噬或凋亡。在組織系統相關基因中，內分泌系統、免疫系統和神經系統基因表達上調也比較明顯（黃色），這與臨床上常見的癥狀相吻合。見圖4。

2.5 EV71 感染RD 細胞對自噬蛋白的影響 高內涵細胞成像結果顯示，RD細胞在感染后細胞數量明顯減少，病毒感染引起細胞產生病變和死亡。但細胞內平均熒光強度明顯增加，隨著病毒進入細胞，引起細胞內自噬蛋白Atg5（F=3.719，P＜0.05）、Rictor（F=3.588，P＜0.05）表達上調，見圖5。

Fig.3 Gene expression changes at different time points of virus intervention圖3 病毒干預不同時間點的基因表達變化

Fig.4 The GO enrichment and KEGG pathway analysis of differential expressed genes of RD cells 3 h after infection with EV71圖4 GO富集和KEGG信號通路分析EV71感染RD細胞3 h后基因差異表達

3 討論

3.1 EV71感染RD細胞6 h即出現病毒復制 結果顯示，RD細胞在感染EV71后0.5 h即可見細胞狀態變差，空斑形成增多；3 h細胞數量明顯下降，說明此時病毒開始在細胞內完成RNA 復制，蛋白質合成、包裝和釋放。Western blot 結果顯示，細胞在病毒感染后6 h才能翻譯出結構蛋白VP-1。病毒感染細胞后病毒RNA釋放進入被感染細胞、RNA復制負鏈互補RNA、翻譯多聚蛋白質、剪切成4 個結構蛋白（VP1～4）和7 個非結構蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）［8-9］，包裝病毒顆粒并釋放。在此過程中，宿主細胞可以通過抑制自噬來增強病毒的復制［3］，但是也可能是通過增強自噬實現對宿主細胞的免疫逃逸［5］。

Fig.5 High content screening showed protein expression after virus infection圖5 高內涵成像顯示病毒感染后蛋白表達情況

3.2 EV71 感染RD 細胞3 h 出現信號通路分子變化 轉錄組測序結果顯示，病毒感染后基因表達變化的峰值出現在3 h，上調基因1 199個，說明該時點是病毒復制和包裝的關鍵點。上調的基因中信號轉導相關216 個，其中大多數與自噬和凋亡有關。Shi等［10］證明EV71 通過引起宿主細胞發生凋亡進而引起病毒的釋放。Yeganeh 等［11］認為 EV71 通過增強宿主細胞的自噬而引起免疫逃逸。為了明確自噬信號通路與病毒復制的關系，本研究進一步分析轉錄組測序數據。

3.3 EV71 感染RD 細胞通過自噬信號分子產生免疫應答 KEGG 信號通路富集分析顯示，在病毒感染后3 h，與自噬相關的多個信號分子被激活，高內涵細胞成像結果也證實在感染后9 h 自噬蛋白Atg5和mTOR 伴侶蛋白Rictor 的表達上升。mTOR 通路是經典的自噬信號通路，與細胞內代謝調控相關，主要受胰島素的激活，對機體能量代謝有重要的調節作用［12］。抑制mTOR 信號通路可以增強細胞自噬，是一種饑餓狀態下細胞調節能量代謝的重要方式，病毒誘導的細胞自噬同時也可以引起mTOR通路的激活［13］。EV71在進入RD細胞后激活mTOR信號分子，增強細胞自噬，有助于細胞清除病毒，但病毒也可能通過激活細胞自噬產生對機體的免疫逃逸作用，有利于病毒在細胞內的復制與釋放。

綜上所述，EV71 感染后3 h 激活宿主細胞自噬信號通路，6 h 病毒衣殼蛋白合成，開始組裝新的病毒，12 h宿主細胞自噬達峰值，新病毒釋放。這種病毒感染過程與細胞自噬有可能是病毒免疫逃逸的一種機制，筆者會持續關注EV71感染后細胞自噬分子時間和空間的變化，以期發現EV71感染細胞后引起免疫應答的確切機制。