沉默Rbfox1對癲癇模型大鼠海馬神經細胞生物學行為的影響及機制研究

馮磊，解利平，張海平，束坤

癲癇是因大腦神經元出現突發性異常放電所引發的腦部功能障礙類疾病，其臨床表現為自主神經、意識、精神障礙及發作性運動[1]。海馬區是中樞神經系統內對癲癇發生最為敏感的腦區，在癲癇發生后會導致海馬神經細胞發生壞死或凋亡，且癲癇發作后對大腦所產生的損傷受海馬神經元凋亡的影響，因此通過抑制海馬神經元凋亡可修復神經元損傷[2]。沉默結合RNA的Fox1基因(Rbfox1)在臨床上又被稱為A2BP1，參與神經系統發育過程，可同時調節神經元興奮和參與轉錄過程， Rbfox1基因突變與智力發育遲滯、癲癇相關[3]。本研究分析沉默Rbfox1基因對癲癇模型大鼠海馬神經細胞生物學行為的影響及其機制，為臨床癲癇治療提供新方向，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物： SD健康雄性大鼠(SPF級)60只(由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供)，體質量220～240 g，飼養溫度22～25℃，室內濕度35%～40%，飼養室定時進行紫外線照射消毒。統一喂給標準飼料，允許自由活動，飼養時間為1周。本實驗獲得醫院倫理委員會批準。(2)試藥試劑：氯化鋰(上海源葉生物科技有限公司)、匹羅卡品(上海熹恒生物科技有限公司)、硫酸阿托品(華中藥業股份有限公司)、戊巴比妥(上海上藥新亞藥業有限公司)；大鼠抗小鼠p-p38抗體(北京華夏遠洋科技有限公司)，大鼠抗小鼠p-JNK抗體(廈門嘉慧生物科技有限公司)；大鼠抗小鼠p-Erk抗體(廈門研科生物技術有限公司)，兔抗大鼠Bax抗體，兔抗大鼠Bcl-2抗體(武漢菲恩生物科技有限公司)，兔抗人Bim抗體(上海振譽生物科技有限公司)。(3)儀器：光學顯微鏡(美國Ted Pella)。

1.2 實驗方法 2019年8月—10月于西電集團醫院神經外科實驗室進行實驗。

1.2.1 慢病毒載體構建： Rbfox1表達沉默的慢病毒載體構建、大鼠Rbfox1序列查找及設計由上海GeneChem公司完成，重組Rbfox1過表達病毒載體(Lentiviral-mediated-Rbfox1)、Rbfox1沉默載體(Lentiviral-mediated-Rbfox1-RNAi)由上海GeneChem公司合成，并經測序驗證后行慢病毒載體構建，病毒滴度為108TU/ml，在制備完成后將重組慢病毒載體在溫度為-80℃下保存。

1.2.2 建模及分組：隨機選取60只大鼠中15只作為空白對照組，其余大鼠均參照陳姝璇等[4]研究中運用氯化鋰—匹羅卡品化學點燃制備癲癇模型，將氯化鋰 3 mEq/kg(125 mg/kg)注射于大鼠腹腔，之后18～24 h將硫酸阿托品1 mg/kg注射于大鼠腹腔，在此0.5 h后以匹羅卡品首次劑量30 mg/kg注射于大鼠腹腔， 0.5 h后觀察大鼠是否出現Ⅳ級以上癲癇發作，若無可每隔0.5 h腹腔注射匹羅卡品10 mg/kg，直至大鼠出現Ⅳ級以上無明顯間歇的癲癇持續狀態。將建模成功的癲癇大鼠模型按隨機數字表法分為模型組、過表達組、沉默組各15只，在無菌環境下將所制備的Rbfox1過表達病毒載體重組慢病毒懸液10 μl注射于過表達組大鼠海馬區，Rbfox1沉默載體重組慢病毒懸液10 μl注射于沉默組大鼠海馬區，正常對照組和模型組不做處理。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 大鼠海馬神經元病理變化：在慢病毒轉染1周后觀察大鼠海馬神經元病理變化。隨機選取各組大鼠1只，腹腔注射3.0%戊巴比妥 80 mg/kg麻醉，迅速取大鼠腦組織，分離海馬組織制作標本，使用4%多聚甲醛固定，常溫下使用15% EDTA脫鈣，脫水后進行石蠟包埋，制作厚3 μm組織切片，行HE染色，以光學顯微鏡觀察大鼠海馬神經元病理變化。

1.3.2 大鼠海馬神經細胞增殖/凋亡情況檢測：在慢病毒轉染1周后檢測大鼠海馬神經細胞增殖/凋亡情況。選取每組大鼠7只腹腔注射3.0%戊巴比妥80 mg/kg麻醉，迅速取腦組織，分離海馬組織，運用酶消化法采集大鼠海馬神經細胞，加入PBS制備成單細胞懸液，調整細胞數為1×106個/ml。采用MTT比色法檢測大鼠24、48、72 h時海馬神經細胞增殖能力，增殖率=(細胞組OD值/參照值-1)×100%，計算大鼠海馬神經細胞增殖率。采用流式細胞儀檢測大鼠24、48、72 h時海馬神經細胞凋亡情況。

1.3.3 大鼠海馬組織中MAPK通路蛋白表達檢測：在慢病毒轉染1周后檢測大鼠海馬組織MAPK通路蛋白表達情況。4組各剩余7只大鼠均腹腔注射3.0%戊巴比妥 80 mg/kg麻醉處死，迅速取腦組織，分離海馬組織在液氮中保存、待用，采用Western-blot法檢測大鼠海馬組織中MAPK通路蛋白p-p38、p-JNK、p-Erk及下游調控蛋白Bax、Bcl-2、Bim表達量，內參蛋白設置為GAPDH。

2 結 果

2.1 4組大鼠海馬神經元病理變化比較 空白對照組大鼠腦皮質、顆粒細胞、齒狀回錐體細胞排列輪廓清晰、緊密， 胞核呈圓形或橢圓形， 核仁清晰，染色質均勻，胞漿透明，周圍有大量膠質細胞分布；模型組大鼠海馬神經元排列紊亂，細胞發生破裂、膨脹，尼氏小體減少；過表達組大鼠海馬神經元細胞排列較為紊亂，細胞水腫顯著增大，細胞間距加大；沉默組大鼠海馬神經元細胞無水腫，細胞間距變小，排列整齊，尼氏小體增加，神經元存活數目增多，見圖1。

2.2 4組大鼠海馬神經細胞凋亡率比較 模型組不同時間點大鼠海馬神經細胞凋亡率高于空白對照組(P<0.01)，且過表達組>模型組>沉默組(P<0.01)，見表1。

表1 4組大鼠海馬神經細胞凋亡率比較

2.3 4組大鼠海馬神經細胞增殖率比較 模型組不同時間點大鼠海馬神經細胞增殖率低于空白對照組(P<0.05)，且過表達組<模型組<沉默組(P<0.01)，見表2。

表2 4組大鼠海馬神經細胞增殖率比較

2.4 4組大鼠海馬組織中MAPK通路蛋白表達量比較 模型組大鼠海馬組織p-p38、p-JNK、p-Erk、Bax、Bim蛋白高于空白對照組，Bcl-2蛋白低于空白對照組(P<0.05)，p-p38、p-JNK、p-Erk、Bax、Bim蛋白表達比較，過表達組>模型組>沉默組，Bcl-2蛋白過表達組<模型組<沉默組(P<0.01)，見表3。

表3 4組大鼠海馬組織中MAPK通路蛋白表達量比較

3 討 論

癲癇的發生與中樞神經系統感染、遺傳、腦卒中等因素相關[1]。但目前臨床上對于影響癲癇大鼠海馬神經細胞生物學行為的機制尚不完全明確，隨著對癲癇發病機制的研究不斷深入，目前認為癲癇的發生與多種基因有關，如KCNT1基因、PRRT2基因、DEPDC5基因等。在本研究中通過沉默Rbfox1基因，分析沉默基因對癲癇模型大鼠海馬神經細胞生物學行為的影響，為臨床研究癲癇提供新方向。

Rbfox1基因大小為1 694 246 bp，主要位于16p13.3，可影響神經元興奮，因此臨床研究認為[5-6]，Rbfox1基因可能與癲癇的發生相關。選擇性剪接以不同的結合方式與外顯子連接，可影響神經發育，改善腦部功能，參與多種神經系統性疾病的發生。研究認為[7-9]，Rbfox1基因可通過與外顯子兩翼的內含子中(U)GCAUG序列選擇性結合，影響神經系統選擇性剪接作用。目前研究發現[10-12]，Rbfox1基因所調控的靶基因包括上皮特異性纖維母細胞生長因子、纖連蛋白基因、GABRB3、GAD2、GABA-A受體γ2的基因等，其所編碼的蛋白質可與微管結合蛋白、激動蛋白等參與細胞構架、遷移、變形過程。Lal等[13]研究認為，Rbfox1基因外顯子缺失會增加特發性全身性癲癇的風險。臨床研究中發現[14]，Rbfox1基因參與頑固性癲癇的發生，且經動物實驗發現，Rbfox1基因在神經元中呈上升趨勢。相關研究表明[15]，當癲癇發生后可誘發神經元死亡，表現為神經細胞凋亡，根據神經細胞凋亡現象可間接反映癲癇的疾病發作程度。本研究構建Rbfox1基因過表達和沉默慢病毒載體，檢測Rbfox1基因沉默和過表達對癲癇大鼠海馬神經細胞增殖、凋亡的影響，結果顯示，與Rbfox1基因過表達相比，Rbfox1基因沉默的大鼠海馬神經細胞凋亡率較低，海馬神經細胞增殖率較高，且基因沉默的大鼠海馬神經細胞凋亡率與增殖率在72 h時與空白對照組差異無統計學意義，此結果提示Rbfox1基因在癲癇大鼠中高表達，可通過沉默其表達修復受損神經細胞，抑制海馬神經細胞凋亡，進而改善癲癇癥狀。

MAPK信號通路參與神經系統疾病的發生發展，臨床可通過抑制MAPK通路蛋白異常表達而減輕神經細胞損傷，MAPK信號通路起主要調控的信號轉導路徑包括p38通路和JNK通路，參與細胞生物學行為。聶荔等[16]探究沉默MAPK通路對大鼠癲癇持續狀態引起海馬神經元損傷的保護作用，其研究證實，抑制MAPK通路可修復海馬神經元損傷，抑制海馬神經元凋亡。本研究發現，沉默Rbfox1基因可利于癲癇大鼠海馬神經細胞增殖，抑制凋亡，為進一步明確沉默Rbfox1基因影響海馬神經細胞的機制，采用Western-blot法檢測4組大鼠海馬組織中MAPK通路蛋白表達量，結果顯示，沉默Rbfox1基因的大鼠海馬組織中MAPK通路蛋白表達量顯著降低，且與空白對照組比較差異無統計學意義，此結果提示，沉默Rbfox1可能通過作用于MAPK通路發揮其調控海馬神經細胞生物學行為的目的。但目前并無沉默Rbfox1基因與MAPK通路調控癲癇大鼠海馬神經系統生物學行為的研究，因此本研究結果還需后續實驗進一步證實。

綜上所述，沉默Rbfox1基因可抑制海馬神經細胞凋亡，促進海馬神經細胞增殖，其作用機制可能與調控MAPK通路相關。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

馮磊：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；解利平：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；張海平：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；束坤：進行統計學分析