HOTAIR、Snail和Wnt3a在HBV相關肝細胞癌組織中的表達及對預后的影響

曾東，馮艷玲，鄭葉，楊月香，石雨涵

肝細胞癌(HCC)已成為全球常見的惡性腫瘤之一，其發病隱匿，初期臨床癥狀和體征不典型，早期不易發現，往往延誤最佳治療時機；此外由于該病侵襲轉移性強而導致預后極差，因此具有較高的發病率和病死率。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染被廣泛認為是導致HCC發生的主要高危因素之一，我國80%的肝癌患者合并HBV感染，HBV感染患者較正常人群發生肝癌的幾率更高[1]。作為首個被發現的通過反式作用調控下游基因表達的長鏈非編碼RNA(Lnc RNA)，HOX 轉錄反義RNA (HOTAIR)已被證實在胃癌、乳腺癌及非小細胞肺癌等多種癌癥中表達明顯上調，且其高表達與腫瘤耐藥、增殖、侵襲及遷移密切相關[2-4]。作為鋅指蛋白超家族成員之一，鋅指轉錄因子(Snail)對上皮間葉表型轉化(EMT) 具有強大的誘導能力，近年來在腫瘤轉移中的作用越來越被重視[5-6]。Wnt3a是Wnt 信號傳導通路的關鍵分子，在胚胎發育、造血、組織再生及細胞增殖分化等生物學過程中發揮關鍵作用，也在多種腫瘤中異常活化并發揮重要作用[7-8]。目前，關于HOTAIR、Snail和Wnt3a通路蛋白在HBV相關肝細胞癌組織中的表達及對預后的意義報道較為少見。因此，本研究通過檢測HOTAIR、Snail和Wnt3a 通路蛋白在HBV相關HCC組織中的表達及其與臨床病理特征的關系，旨在探討三者在HBV相關HCC發生發展過程中的作用及其對預后的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年6月—2014年12月于復旦大學附屬上海市公共衛生臨床中心病理科經手術切除并經病理確診的HBV相關肝細胞癌組織樣本82份，患者血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)為陽性，甲型、丙型、丁型及戊型肝炎病毒均為陰性；術前增強CT和腹部B型超聲均明確診斷為原發性HCC，且未接受任何抗癌治療；術后病理組織學確診為HCC；不合并其他疾病，無器質性疾病和既往惡性腫瘤史。82例中男66例，女16例，年齡36～75 (53.82±9.47) 歲，>50歲49例，≤50歲33例；淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移57例；腫瘤直徑：>5 cm 44例，≤5 cm 38例；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)：升高>2倍17例，≤2倍65例；甲胎蛋白：<400 μg/L 63例，≥400 μg/L 19例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ 期55例；分化程度：低分化21例，中分化49例，高分化12例；E 抗原：陽性11例，陰性71例；未行抗乙肝病毒治療者72例，行抗乙肝病毒治療者10例。另外選擇同期于醫院經手術切除的正常肝組織樣本35份，患者無肝炎史，且血清甲型、丙型、丁型及戊型肝炎病毒等檢測均為陰性；臨床癥狀結合腹部CT和B型超聲等診斷為肝臟良性血管瘤或肝內膽管多發結石，且術后經病理組織學證實；正常肝組織樣本為病變旁組織；不合并其他疾病，且無既往病史。其中男28例，女7例，年齡35～75 (54.13±9.52) 歲，>50歲21例，≤50歲14例；因肝臟良性血管瘤切除8例，因肝內膽管多發結石切除27例。

1.2 觀測指標與方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測HOTAIR：將收集的HBV相關肝細胞癌組織和正常肝組織，采用Trizol(TaKaRa公司)法提取各組織中總RNA并進行濃度測定，之后采用試劑盒Trans Script mi RNA First-Strand c DNA Synthesis Super Mix(北京全式金生物技術有限公司)對提取的總RNA進行反轉錄以獲取cDNA，將得到的cDNA作為模板，采用Trans Start Top Green q PCR super Mix(北京全式金生物技術有限公司)進行實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，檢測HOTAIR在HBV相關肝細胞癌組織和正常肝組織中的表達，引物序列：上游5’-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3’，下游5’-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3’；同時以微管蛋白(TUBULIN)作為內參基因，引物序列：上游5’-TGGCTCTGGCTTCACCTCACTC-3’，下游 5’-TCGACCACGGCTGTAGACACC-3’；每個樣本均重復3次，采用 2-ΔΔCt計算HOTAIR的相對表達量。以大于正常肝組織中HOTAIR相對表達量平均值2倍判為陽性。

1.2.2 免疫組織化學檢測Snail和Wnt3a蛋白：用4%中性甲醛溶液將收集的肝組織樣本固定后，依次進行脫水、透明及石蠟包埋，再連續切成5 μm厚的切片，置入二甲苯中脫蠟處理，然后經梯度乙醇浸泡水化及3 mol/L尿素消化，之后采用枸櫞酸鈉溶液修復抗原，3%雙氧水室溫下孵育10 min后封閉，棄封閉液，分別加入適量稀釋好的一抗Anti-SNAIL抗體(山羊多克隆抗體to SNAIL,Abcam公司)和Anti-Wnt3a抗體(兔多克隆抗體to Wnt3a,Abcam公司)，置于4℃冰箱孵育過夜，次日取出，復溫后加磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗干凈，再分別加入適量稀釋好的二抗驢抗山羊IgG H&L (HRP)(Abcam公司)和山羊抗兔IgG H&L (HRP)(Abcam公司)，室溫孵育30 min，PBS洗滌干凈。加適量二氨基聯苯胺(DAB 顯色試劑盒,北京中杉金橋生物技術有限公司)用于顯色，作用5 min后加去離子水以使反應終止，蘇木素復染后，加1%鹽酸酒精進行分化，之后用自來水清洗并經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，干燥后封片，鏡檢觀察。

病理切片需由2位資深專業的病理科醫師盲評。在每張切片上隨機選取5個高倍鏡視野，每個視野隨機對200個細胞進行計數，陽性表達為細胞出現棕黃色或黃色顆粒，最終以組織樣本中陽性細胞染色強度及其所占比例對染色結果進行綜合評定。染色強度計分按照無著色、淡黃色、棕黃色及棕褐色順序分別計0分、1分、2分、3分。陽性細胞數計分按照無陽性細胞、陽性細胞< 25%、陽性細胞26%～50%、陽性細胞51%～75%、陽性細胞>75%分別計0分、1分、2分、3分及4分。以上2項計分相加后≥3分判為陽性。

1.2.3 隨訪預后：HBV相關肝細胞癌患者手術后安排專門人員定期進行門診或電話隨訪，隨訪終點為患者死亡時間或2019年12月20日。建議患者至少每3個月于醫院行甲胎蛋白、肝臟MR或增強CT、肝功能、乙型肝炎表面抗原、E抗原及血清HBV DNA檢查，必要時可行骨掃描或病灶穿刺病理檢查。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計學分析。計數資料以頻數或率(%)表示，比較采用χ2檢驗；3種蛋白在HBV相關HCC組織中表達的相關性分析采用Spearman秩相關檢驗；組間生存率比較采用GraphPad Prism軟件的Log-rank(Mantel-Cox)檢驗；生存曲線采用Kaplan-Meier繪制；Cox回歸比例風險模型分析影響患者的預后因素。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 HOTAIR、Snail和Wnt3a在HBV相關HCC組織中的表達 HBV相關肝細胞癌組織中HOTAIR相對表達量的平均值為(9.85±0.87)，正常肝組織中為(4.69±0.42)，二者比較差異有統計學意義(t/P=33.406/0.000)；HOTAIR、Snail及Wnt3a在HBV相關肝細胞癌組織中的陽性表達率分別為85.37%、78.05%及89.02%，在正常肝組織中分別為20.00%、17.14%及25.71%，差異有統計學意義(χ2=46.582、 37.861、 46.896,P均<0.01)，見圖1，表1。

表1 HOTAIR、Snail和Wnt3a蛋白表達的陽性率比較 [例(%)]

2.2 HOTAIR、Snail和Wnt3a在不同臨床病理特征患者中的表達 HBV相關肝細胞癌組織中HOTAIR、Snail及Wnt3a的表達在不同性別、年齡、E 抗原、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、有無行抗乙肝病毒治療及甲胎蛋白水平方面比較，差異均無統計學意義 (P>0.05)。HOTAIR在患者不同TNM 分期、組織分化程度、淋巴結轉移及腫瘤直徑方面比較，差異均有統計學意義 (P<0.01)；Snail在不同TNM 分期和淋巴結轉移方面比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；Wnt3a在不同TNM 分期、組織分化程度及腫瘤直徑方面比較，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 82例HBV相關HCC患者中HOTAIR、Snail和Wnt3a表達在不同臨床病理特征中表達比較 [例(%)]

2.3 HOTAIR、Snail和Wnt3a在HBV相關HCC組織中表達的相關性 Spearman相關性分析顯示，HBV相關肝細胞癌組織中HOTAIR的表達與Snail、Wnt3a的表達呈正相關 (r/P=0.281/0.011、0.296/0.007)，Snail與Wnt3a的表達呈正相關(r/P=0.285/0.009)。

2.4 Cox比例風險回歸模型分析HBV相關HCC臨床預后的影響因素 結果顯示，TNM 分期高、組織分化程度低、淋巴結轉移、腫瘤直徑大，HOTAIR、Snail及Wnt3a高表達是影響HBV相關肝細胞癌預后的危險因素 (P<0.05)，見表3。

表3 Cox比例風險回歸模型分析HBV相關 HCC臨床預后的影響因素

2.5 HOTAIR、Snail和Wnt3a表達與HBV相關肝細胞癌患者的生存分析 HBV相關肝細胞癌82例患者5年總生存率為52.44%。HOTAIR、Snail、Wnt3a陽性患者的5年生存率顯著低于其陰性患者(47.14% vs. 83.33%、45.31% vs. 77.78%、47.95% vs. 88.89%)(χ2/P=5.380/0.020,5.937/0.015,5.385/0.020)，見圖2。

3 討 論

目前，肝細胞癌的治療以手術為主，輔助其他治療，盡管治療方法較多，但僅能使患者生存期有限延長，預后效果并不理想。基因突變、染色體變異、表觀遺傳學改變及多種信號傳導通路異常調節均參與肝細胞癌的發生發展，是一個復雜的多階段過程[9]。乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)由HBV基因組最小的開放式閱讀框架X基因(X-ORF) 編碼，作為一種反式作用因子不直接結合DNA，而是將多種細胞的基因啟動子激活以干擾基因轉錄和表達，進而影響細胞分化、增殖及細胞信號轉導途徑[10]。HBV侵染宿主是通過將自身基因組整合到宿主肝細胞基因組中并表達HBx蛋白，最新研究結果表明，HBx蛋白對肝細胞癌侵襲轉移及惡性轉化具有促進作用，且可通過誘導肝癌細胞發生EMT、促進細胞外基質降解及干擾癌細胞間的黏附連接等途徑完成[11]。

位于人類染色體12q13.13區域的HOTAIR不編碼蛋白質，但可編碼2.2 kb長鏈非編碼RNA 分子，通過改變染色質狀態，反式調控下游靶基因表達。早期文獻報道，敲除HOTAIR對胃癌細胞的增殖、侵襲具有抑制作用，胃癌細胞在體內的致癌性被有效降低，過表達HOTAIR則使腫瘤細胞的惡性潛能顯著增加[12-13]。Troiano等[14]研究顯示，喉鱗狀細胞癌中HOTAIR呈高表達，且與腫瘤細胞的生長關系密切。轉錄抑制子超家族成員中的鋅指轉錄因子Snail，可結合上皮鈣黏素(E-cadherin, E-cad)啟動子區的E-box連接基序，以對E-cad 轉錄表達發揮抑制作用，從而誘導 EMT 的發生。位于染色體17q21上的Wnt3a是Wnt 經典通路的關鍵信號分子，經磷脂酰肌醇蛋白多糖-3和硫酸酯酶-2激活后，對肝癌細胞增殖和裸鼠皮下移植瘤的生長具有促進作用[15]。本研究顯示，HBV相關肝細胞癌組織中HOTAIR相對表達量顯著高于正常肝組織(P<0.05)。HOTAIR、Snail及Wnt3a在HBV相關肝細胞癌組織中的陽性表達率顯著高于正常肝組織(P<0.05)。該結果與以往研究報道一致[16]。HBV相關肝細胞癌組織中HOTAIR、Snail、Wnt3a的表達，兩兩之間互為顯著性正相關(P均<0.05)。細胞實驗表明，在人類卵巢癌細胞中，過表達HOTAIR可通過激活Wnt/β-catenin信號通路誘導卵巢癌的發生和抗藥性[17]。模型實驗顯示，HOTAIR通過介導Wnt/β-catenin對MMP-13的調控參與軟骨損傷發病[18]。Battistelli等[19]發現，上皮間葉表型轉化過程中抑制因子Snail是通過HOTAIR將EZH2招募至特定基因組位點的。肺癌細胞系中敲除Zeb1和Snail1后，E-cad mRNA水平增加，侵襲性降低；敲除β-catenin后使E-cad升高，Zeb1和Snail1降低，進而使肺癌的侵襲性被抑制，表明Wnt信號通路通過Snail1和Zeb1調控肺癌骨轉移[20]。以上資料均證實HOTAIR、Snail及Wnt3a之間在多種疾病中具有直接或間接的正相關性，與本研究結果相符。

本研究結果表明，HOTAIR、Snail及Wnt3a均與HBV相關肝細胞癌的惡性生物學行為關系密切。Snail對EMT具有強大的誘導能力，因此極易促進淋巴結轉移，從而使其惡性程度增加，TNM 分期升高。異常活化的Wnt3a對肝癌細胞的增殖和分化發揮重要作用，因此，Wnt3a與TNM 分期、組織分化程度及腫瘤直徑有關。HOTAIR易與miRNA、靶基因形成競爭性內源RNA網絡，通過影響多條通路的基因表達以使該通路被激活，從而促進腫瘤細胞的增殖轉移等生物學過程，因此，HOTAIR與TNM 分期、組織分化程度、淋巴結轉移及腫瘤直徑有關。該結果與HOTAIR、Snail及Wnt3a的生物學作用相符[21]。Cox比例風險模型分析結果顯示，除TNM 分期高、組織分化程度低、淋巴結轉移、腫瘤直徑大外，HOTAIR、Snail及Wnt3a高表達也是影響HBV相關肝細胞癌預后的關鍵風險因素 (P<0.05)。本研究所選82例HBV相關肝細胞癌患者5年總生存率為52.44%，HOTAIR、Snail及Wnt3a陽性患者的5年生存率均顯著低于陰性患者(P<0.05)。以上結果證實，HOTAIR、Snail及Wnt3a不僅參與HBV相關肝細胞癌的發生發展，還嚴重影響患者的臨床預后，降低患者生存率。

綜上，HBV相關肝細胞癌中HOTAIR、Snail及Wnt3a均高表達且互為顯著正相關性，不僅參與癌癥的惡性進展，還是導致患者預后不良的關鍵風險因素。盡管三者之間的相互作用機制復雜，目前尚不完全清楚，但對HBV相關肝細胞癌的診治具有重要的潛在價值，今后將深入研究其詳細作用機制，為開發針對特定靶點的拮抗劑以有效對抗HBV相關肝細胞癌奠定新的基礎。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

曾東：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；馮艷玲：課題設計，論文撰寫；鄭葉、楊月香：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核;石雨涵：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改，統計學分析