鹽脅迫下 OsDSR2 RNAi轉基因水稻的主要農藝性狀分析

楚樂樂，羅成科，路旭平，李芳蘭，馬天利，李培富

(寧夏大學 農學院，寧夏優勢特色作物現代分子育種重點實驗室，銀川 750021)

水稻是中國的主要糧食作物，也是功能基因組研究的模式作物。近年來由于人類活動的影響，土壤鹽堿化程度加劇，耕地面積減少，致使包括西北地區在內的同類水稻產區的種植面積和產量受到限制，嚴重影響著農業的可持續發展[1]。隨著現代生物技術的發展，充分挖掘并克隆耐鹽相關基因，進一步利用轉基因技術培育耐鹽水稻品種，提高水稻產量和品質，成為主要育種手段 之一。

Nakashima等[2]研究認為OsNAC6(與SNAC2為同一基因)過表達轉基因水稻雖增強了耐鹽性，但轉基因水稻生長滯后且產量下降。He等[3]研究證實可溶性無機焦磷酸酶基因ThPP1通過上調差異表達基因調節磷酸鹽和滲透調節物質的積累，進而增強轉基因水稻植株的耐鹽堿性。Guo等[4]和Guan等[5-6]先后報道ALT1、OsLOL5和OsCu/Zn-SOD基因參與水稻對鹽堿脅迫的應答。Zou等[7]研究發現OsABI5是一個水稻耐鹽的負調節子，OsABI5的抑制表達轉基因水稻顯示出較強的抗逆性。Tao等[8]和Liu等[9]研究表明OsWRKY45-2和OsERF922負調控對鹽脅迫具有一定耐受性。近年來，關于正向調控水稻響應鹽脅迫基因的研究較多，關于負向調控水稻響應鹽脅迫基因的研究相對較少，鹽脅迫下基因抑制表達后對水稻主要農藝性狀調控的研究更少，而本試驗中OsDSR2(LOC_Os01g62200, DUF966-stress repressive gene2inOryzasativa)是一個多脅迫抑制基因，該基因參與水稻逆境脅迫應答，OsDSR2基因的超量表達增加了轉基因水稻植株對鹽脅迫的敏感性，暗示OsDSR2可能負調控水稻對鹽脅迫的耐受性[10]。

實驗室前期構建了OsDSR2RNAi抑制表達載體，獲得了抑制表達轉基因水稻植株，并進一步對T3代OsDSR2RNAi轉基因水稻四葉期的植株進行了表型鑒定和逆境生理指標(脯氨酸、可溶性糖、細胞膜透性、丙二醛、抗氧化酶活性、Na+、K+含量等)的測定。結果表明，OsDSR2RNAi抑制表達轉基因水稻在表型上表現出一定的耐鹽性，在生理層面上，主要通過降低細胞膜透性、丙二醛(MDA)含量和Na+/K+，增加脯氨酸(Pro)和過氧化物酶(POD)活性來提高苗期水稻植株的耐鹽性。在此基礎上，開展鹽脅迫下OsDSR2RNAi抑制表達轉基因水稻的農藝性狀特性的研究，旨在揭示鹽脅迫下OsDSR2抑制表達后對主要農藝性狀的影響，闡明OsDSR2參與調控水稻耐鹽機制，為進一步闡明OsDSR2參與調控水稻耐鹽性作用機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所用的水稻材料為野生型中花11(ZH11)和T2代OsDSR2RNAi轉基因水稻的兩個不同株系(DR14和DR20)。其中，ZH11為對照(CK)，OsDSR2RNAi轉基因水稻植株作為研究材料。 該材料是根據OsDSR2的cDNA序列及其蛋白質的保守結構域，通過擴增OsDSR2基因的RNAi目標片段(約300 bp)，將其構建到干擾載體上，利用農桿菌介導的遺傳轉化方法獲得，并對目的基因片段及其表達量進行了檢測，篩選出陽性植株，最終選擇干擾表達最為明顯的兩個株系(DR14和DR20)作為后續研究材料。

1.2 處理與方法

ZH11種子置于1/2 MS(Murashige and Skoog)培養基上發芽，轉基因水稻種子在含有潮霉素的1/2 MS培養基上篩選發芽，待幼苗長至第3片葉時進行煉苗培養，挑選長勢一致的幼苗培養至四葉期，移植于盆栽中(黃土與培養基按體積比為3:2混合而成)，盆栽置于寧夏大學科教園區溫棚內，轉基因材料與其對應的野生型植株分別種10盆，每盆5株。盡量保證轉基因植株和野生型植株相鄰種植，試驗設置3次重復，隨機排列，當大部分材料進入幼穗分化期時，ZH11和轉基因水稻分別隨機挑選3盆，添加0.15 mol/L NaCl溶液進行鹽脅迫處理21 d后，換水恢復。此外，隨機挑選3盆不添加NaCl(Normal)即正常條件。待植株成熟后統計穗長、千粒質量、每穗總粒數等主要農藝性狀。

1.3 數據的統計與分析

采用 SPSS 19.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，最小顯著差異法(LSD)進行多重比較，利用OriginPro 2017軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 OsDSR2 RNAi轉基因水稻植株穗長與單株穗數

如圖1所示，鹽脅迫處理前后，OsDSR2RNAi轉基因植株的穗長與野生型ZH11均有極顯著差異性(P<0.01)。鹽脅迫處理引起兩種不同材料的單株穗數的減少，在正常條件下，OsDSR2RNAi轉基因植株(DR14和DR20)的單株穗數顯著小于ZH11(P<0.05)，均為9.67，但是鹽脅迫條件下，OsDSR2RNAi轉基因植株的單株穗數分別為5.00和4.33，而ZH11的單株穗數為3.00。OsDSR2RNAi轉基因植株的單株穗數顯著高于ZH11(P<0.05)，說明鹽脅迫下OsDSR2的抑制表達，可以通過抑制單株穗數的降低來提高其對鹽脅迫的適應性。

2.2 OsDSR2 RNAi轉基因水稻植株每穗的總粒數、實粒數與結實率

如圖2所示，正常條件下，OsDSR2RNAi轉基因植株與野生型ZH11的每穗總粒數、每穗實粒數均無顯著差異性。鹽脅迫處理后，OsDSR2RNAi轉基因植株與野生型ZH11的每穗總粒數、每穗實粒數均有所降低，但兩種材料之間均無顯著差異性；相比于正常條件下，鹽脅迫處理引起了兩種植株的結實率降低，鹽脅迫后ZH11的結實率為0.23，OsDSR2RNAi轉基因植株的結實率為0.27，OsDSR2RNAi轉基因植株的結實率顯著高于ZH11(P<0.05),說明鹽脅迫下OsDSR2的抑制表達，可以通過抑制結實率的降低來提高其對鹽脅迫的適應性。

2.3 OsDSR2 RNAi轉基因水稻植株單株粒質量與千粒質量

如圖3所示，相比于正常條件下，鹽脅迫處理后OsDSR2RNAi轉基因植株與ZH11的千粒質量降低，但兩種材料在鹽脅迫處理前后均無顯著差異性；但轉基因植株的千粒質量高于ZH11的千粒質量。正常條件下，ZH11的單株粒質量為38.06 g，OsDSR2RNAi轉基因植株DR14和DR20的單株粒質量為24.42 g，24.49 g，OsDSR2RNAi轉基因植株的單株粒質量極顯著低于對照(P<0.01)，而鹽脅迫處理后兩種材料的單株粒質量并無顯著性差異。說明鹽脅迫下OsDSR2的抑制表達，可以通過抑制單株粒質量的降低來提高其對鹽脅迫的適應性。

*表示P<0.05 的顯著水平，**表示 P<0.01 的顯著水平，下同

圖2 鹽脅迫下 OsDSR2 RNAi轉基因水稻植株中每穗總粒數、每穗實粒數和結實率Fig.2 Total grains, filled grains per panicle and filled grain rate in OsDSR2 RNAi transgenic rice plants under salt stress

圖3 鹽脅迫下 OsDSR2 RNAi轉基因水稻植株千粒質量和單株粒質量Fig.3 Grain mass per plant and 1 000-grain mass in OsDSR2 RNAi transgenic rice plants under salt stress

2.4 OsDSR2 RNAi轉基因水稻植株主要農藝性狀相關性

在正常條件下(表1)，ZH11的千粒質量與穗長、每穗總粒數、每穗實粒數、每穗實粒率、單株粒質量呈正相關性，與單株穗數呈負相關性，其中與穗長呈極顯著正相關性(P<0.01)；單株粒質量與每穗總粒數、每穗實粒數呈負相關性，與結實率呈正相關性；單株穗數與每穗實粒數、結實率呈負相關性，其中與結實率呈顯著負相關性(P< 0.05)；結實率與穗長呈正相關性，每穗實粒數與穗長、每穗總粒數呈正相關性。

與正常條件下相比，鹽脅迫處理后(表2)，ZH11植株的千粒質量與穗長、每穗總粒數、每穗實粒數、單株粒質量呈負相關性，而與單株穗數呈正相關性，單株粒質量與每穗總粒數變為呈正相關性，與每穗實粒數、結實率呈負相關性，其中結實率呈顯著負相關(P<0.05)，單株穗數與每穗實粒數呈負相關性，但二者之間已無顯著性差異，而與結實率變為呈正相關性，結實率與穗長變為呈顯著負相關性(P<0.05)，每穗實粒數與穗長、每穗總粒數變為呈負相關性。

表1 正常條件下ZH11植株主要農藝性狀相關性Table 1 Correlation of main agronomic traits in ZH11 plants under normal condition

表2 鹽脅迫后ZH11植株主要農藝性狀相關性Table 2 Correlation of main agronomic traits in ZH11 plants under salt stress

在正常條件下(表3)，OsDSR2RNAi轉基因植株的千粒質量與每穗總粒數、每穗實粒數、結實率、單株穗數、單株粒質量呈正相關性，其中與每穗實粒數、結實率、單株穗數呈顯著正相關性(P<0.05)；單株粒質量與穗長、結實率呈正相關性，與每穗總粒數呈負相關性，其中與結實率呈顯著正相關性(P<0.05)；單株穗數與穗長、結實率呈正相關性，其中與結實率呈極顯著正相關性 (P<0.01)；結實率與穗長、每穗總粒數呈正相關性，其中與穗長呈顯著正相關性(P<0.05)；每穗實粒數與穗長、每穗總粒數呈正相關性，其中與每穗總粒數呈極顯著正相關性(P<0.01)；每穗總粒數與穗長呈正相關性。

鹽脅迫處理后(表4)，OsDSR2RNAi轉基因植株的千粒質量與每穗總粒數、每穗實粒數，結實率，單株穗數，單株粒質量變為呈負相關性，其中與每穗實粒數呈顯著負相關性(P<0.05)。單株粒質量與穗長、結實率呈負相關性，而與每穗總粒數變為呈正相關性。單株穗數與穗長、結實率變為呈負相關性。結實率與穗長、每穗總粒數變為呈負相關性。每穗實粒數與穗長呈負相關性，與每穗總粒數呈正相關性，但無顯著性差異。每穗總粒數與穗長呈負相關性,結實率與穗長呈負相關性。

表3 正常條件下 OsDSR2 RNAi轉基因水稻植株主要農藝性狀的相關性Table 3 Correlation of main agronomic traits in OsDSR2 RNAi transgenic rice plants under normal condition

表4 鹽脅迫后 OsDSR2 RNAi轉基因水稻植株主要農藝性狀的相關性Table 4 Correlation of main agronomic traits in OsDSR2 RNAi transgenic rice plants after salt stress

2.5 OsDSR2 RNAi轉基因水稻植株主要農藝性狀主成分分析

對穗長、每穗總粒數、每穗實粒數、結實率、單株穗數、單株粒質量、千粒質量等7個指標進行主成分分析，再從7個特征根中選取較大的2個特征根及特征向量,如表5和圖4所示，正常條件下，第一主成分的遺傳方差累積百分率為 61.36%，每穗實粒數、千粒質量等特征向量較大，單株穗數(最大)，在第二主成分中,方差累積百分率為100%,其特征向量中結實率和單株粒質量較大,每穗總粒數和每穗實粒數較小；相比于正常條件下，鹽脅迫處理后，第一主成分的遺傳方差累積百分率為75.08%，每穗實粒數，結實率、千粒質量特征向量變為負值，單株穗數、單株粒質量變為正值，穗長的特征向量最大，第二主成分的遺傳方差累積百分率為100%，千粒質量的特征向量變為最大。說明鹽脅迫下，ZH11植株第一主成分中，隨著穗長、單株粒質量、每穗總粒數的增大，會使每穗實粒數，結實率和千粒質量變小，第二主成分中，隨著單株粒質量和千粒質量的增大，每穗總粒數和每穗實粒數減小。

表5 鹽脅迫下ZH11植株特征根和累積百分率Table 5 Selected eigen value and cumulative frequencyin ZH11 plants under salt stress

A.穗長；B.每穗總粒數；C.每穗實粒數；D.結實率；E.單株穗數；F.單株粒質量；G.千粒質量；下同

表6和圖5所示，正常條件下，第一主成分的遺傳方差累積百分率為64.48%，7個指標的特征向量均為正值，其中以結實率、單株穗數、千粒質量的特征向量最大，在第二主成分中,方差累積百分率為90.64%,其中每穗總粒數的值和單株粒質量的特征向量較高；相比于正常條件下，鹽脅迫處理后，第一主成分的遺傳方差累積百分率為41.42%，結實率，千粒質量特征向量變為負值，第二主成分的遺傳方差累積百分率為84.31%，單株穗數、單株粒質量特征向量變為正值，結實率特征向量變為最大(負值)。說明鹽脅迫下，OsDSR2RNAi轉基因植株中第一主成分中，隨著每穗實粒數和單株粒質量的增大，穗長和千粒質量變小。第二主成分中，隨著每穗總粒數、單株穗數和千粒質量的增大，穗長和單株粒質量增大，每穗實粒數和結實率減小。

表6 鹽脅迫下 OsDSR2 RNAi轉基因水稻植株特征根和累積百分率Table 6 Selected eigenvalue and cumulative frequency in OsDSR2 RNAi transgenic riceplants under salt stress

圖5 鹽脅迫下 OsDSR2 RNAi轉基因水稻植株主成分分析的載荷圖Fig.5 Load diagram of principal component analysis in OsDSR2 RNAitransgenic plants under salt stress

3 討 論

優質、高產是水稻育種的主要目標,而高產的實現與農藝性狀是相輔相成的，穗粒數、千粒質量、結實率等是反應稻谷產量重要性狀[11-12]。張秀茹等[13]認為水稻產量與穗數、千粒質量、株高等達到極顯著相關水平。本試驗中通過比較OsDSR2RNAi轉基因植株與ZH11鹽脅迫前后的水稻主要農藝性狀特點發現，鹽脅迫處理后OsDSR2RNAi轉基因植株的單株穗數和結實率均顯著高于ZH11，單株粒質量由極顯著低于野生型ZH11變為無顯著性差異，而鹽脅迫處理前后OsDSR2RNAi轉基因植株和ZH11的千粒質量、每穗總粒數、每穗實粒數均無顯著性變化，說明鹽脅迫后，OsDSR2的抑制表達可以通過抑制單株穗數、結實率和單株粒質量的降低來穩定水稻產量，從而達到對于鹽脅迫的適應性。

水稻產量由每穗粒數、結實率、千粒質量等性狀構成,不同研究結果發現各性狀之間有著不同的關系，聶守軍[14]研究發現穗長與每穗穗數存在顯著的正相關性。高良艷等[15]研究認為，單株的產量與結實率以及千粒質量之間均呈正相關。李建國等[16]研究發現，千粒質量對單株產量影響不明顯，結實率與單株產量相關性較大。而本試驗通過對水稻7個主要農藝性狀相關性的分析發現，正常條件下，OsDSR2RNAi轉基因植株的千粒質量與每穗實粒數、結實率、單株穗數間呈顯著正相關性，結實率與單株粒質量、穗長間均呈顯著正相關性,與單株穗數間呈極顯著正相關性,每穗實粒數與每穗總粒數間呈極顯著正相關性,鹽脅迫處理后,千粒質量與每穗實粒數呈顯著負相關性。相對于ZH11鹽脅迫前后變化，OsDSR2RNAi轉基因植株的千粒質量受每穗實粒數、結實率和穗數的共同影響，而其結實率也同樣受到單株穗數、單株粒質量和穗長的共同影響，但OsDSR2RNAi轉基因植株的結實率在鹽脅迫后與單株穗數呈負相關性。綜上說明，鹽脅迫后，OsDSR2的抑制表達，可以通過影響千粒質量與每穗實粒數、結實率、單株穗數的關系，以及結實率與單株穗數的關系，從而影響水稻的產量。

各主成分之間是一個獨立的系統，采用主成分分析法對研究材料的眾多形態學性狀進行綜合評價與分析已被廣泛用于作物種質資源研究與品種選育,并取得了一定的應用效果[17-18]。本試驗通過對水稻ZH11和OsDSR2RNAi轉基因植株主要農藝性狀的主成分分析發現，相比于正常條件下，鹽脅迫處理后，第一主成分穗長的特征向量最大，第二主成分中千粒質量的特征向量最大。而OsDSR2RNAi轉基因植株第一主成分中單株粒質量的特征向量最大，千粒質量次之，為主要影響因子。隨著單株粒質量和每穗實粒數的增大，結實率和千粒質量變小，而鹽脅迫后OsDSR2的抑制表達，抑制了轉基因植株單株粒質量的降低，從而使OsDSR2RNAi轉基因植株的結實率和千粒質量相對于ZH11有所增大。在第二主成分分析中結實率的特征向量最大，為主要影響因子，隨著結實率和每穗實粒數減小，每穗總粒數、單株穗數和千粒質量的增大。鹽脅迫后OsDSR2RNAi轉基因植株和ZH11的結實率均降低，OsDSR2RNAi轉基因植株顯著高于ZH11的結實率，可能是鹽脅迫下OsDSR2的抑制擾表達抑制OsDSR2RNAi轉基因植株的結實率降低，從而使OsDSR2RNAi轉基因植株的單株穗數和千粒質量的增大，這與孫耀中等[19]在NaCl脅迫下轉BADH基因水稻農藝性狀的主成分及聚類分析的研究結果相似，均證明了單株粒質量、結實率和千粒質量轉基因植株適應鹽脅迫的質量要影響因子，說明OsDSR2的干擾表達使單株粒質量和結實率成為影響鹽脅迫下水稻產量重要 因素。

4 結 論

相比于ZH11植株，鹽脅迫后OsDSR2可以抑制水稻植株的單株穗數、結實率和單株粒質量的降低，協調單株粒質量與單株穗數、結實率、千粒質量的關系，從而調控鹽脅迫下水稻的產量。