新疆野生蘋果林蘋小吉丁的伴生真菌多樣性*

周忠福 趙文霞 林若竹 淮穩霞 姚艷霞

(國家林業與草原局森林保護學重點實驗室 中國林業科學院森林生態環境與保護研究所 北京 100091)

新疆野生蘋果(Malussieversii)(薔薇科)屬第三紀孑遺植物，是現代栽培蘋果品種的祖先，是我國乃至世界十分珍貴的自然種質資源，在野生種質資源利用和生物多樣性保護方面具有非常重要的價值(林培鈞等， 2000)。新疆野生蘋果僅分布于中亞地區，是我國新疆西天山野果林最主要的建群種，占野果林總面積的90%。然而，近年來，新疆野生蘋果林出現大面積死亡現象，使這種珍稀種質資源面臨著嚴重的威脅，其中，以蘋小吉丁(Agrilusmali)(鞘翅目Coleoptera: 吉丁甲科Buprestidae)為主的病蟲害是一項非常重要的影響因子(崔志軍， 2018； Bozorovetal.， 2019)。

蘋小吉丁在國外分布于俄羅斯、蒙古和朝鮮半島，在我國分布于黑龍江、遼寧、山東、河北、陜西、四川、甘肅、青海、新疆、內蒙古、河南等十多個省(自治區)(王智勇， 2013； EPPO， 2018)，以幼蟲蛀食寄主樹木枝干而造成危害，枝條被害處表皮呈黑褐或深褐色，稍下凹，受害枝條常常干枯，主要危害蘋果屬(Malus)和李屬(Prunus)植物(Bozorovetal.， 2019； EPPO， 2018)。由于蘋小吉丁在新疆西天山野果林內暴發，已有超過80%的野生蘋果樹受到蘋小吉丁的危害(崔志軍， 2018)。根據伊犁地區林業部門的統計，截至2015年，受害嚴重的新源縣野生蘋果枯死率高達80%，局部地區100%，蘋小吉丁為害被認為是引起新疆野生蘋果死亡的重要生物因子(Bozorovetal.， 2019;季英等， 2004； 王智勇， 2013)。

事實上，昆蟲伴生的真菌類群常常加速了害蟲對寄主植物的危害。伴生菌是由昆蟲攜帶、傳播到寄主植物上，并對寄主植物產生不利影響的病原真菌(葉輝，1997)，也稱為蟲道真菌(楊群芳等， 2008)。迄今為止，昆蟲伴生真菌研究最廣泛的是涉及小蠹科(Scolytidae)昆蟲的種類，其與小蠹科伴生關系最密切，研究最深入的真菌當屬長喙殼類(呂全， 2007； Kostovciketal.， 2015； Luetal.， 2010; 2011； 2016)。其次，象甲科(Curculionidae)昆蟲的伴生真菌也有研究報道，相比小蠹與真菌的緊密伴生關系，除了極少數能與真菌形成互惠的共生關系外, 象甲和真菌之間的伴生關系主要是松散的、隨機的(Drenkhanetal.， 2017； Viiri， 2004; Robertetal.， 2013a； 2013b)。此外，極少數天牛種類如斷眼天牛(Tetropium)據記載也與真菌伴生，主要是長喙殼類真菌(Wingfieldetal.， 1987； Johnyetal.， 2012)。吉丁甲科的昆蟲種類鮮有伴生真菌的報道，截至目前，僅發現Agrilusgraminis是一些黃萎病真菌(Verticillium)的活性載體(Rizieroetal.， 2016)。

調查、分析昆蟲伴生真菌多樣性，了解其群落結構有助于探討害蟲、伴生真菌與寄主植物三者的相互關系。本研究運用真菌學和群落生態學方法，對蘋小吉丁伴生真菌類群及其多樣性進行調查研究，旨在了解和探明蘋小吉丁優勢伴生菌群類群，為探討蘋小吉丁及其伴生真菌與新疆野生蘋果之間的相互作用和危害過程中是否存在伴生真菌協同發生作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

新疆野生蘋果在我國境內主要分布在天山西部伊犁河谷地區海拔 1 200 ～1 600 m 的陰坡、半陰坡和河谷地帶，該地區屬北溫帶大陸性半干旱氣候區，氣候溫和，年平均氣溫10.4 ℃，年積溫為2 700～3 500 ℃，全年日照時數2 532～2 722 h，年降水量315.6～798.3 mm，年均無霜期156天。新疆野生蘋果伴生有野生櫻桃李(Prunuscerasifera)、野杏(Armeniacavulgarisvar.ansu)、準噶爾山楂(Crataegussongarica)、天山樺(Betulatianschanica)等樹種，林下伴生有灌木新疆忍冬(Loniceratianschanica)、黑果小檗(Berberisatrocarpa)、 腺齒薔薇(Rosaalbertii)和覆盆子(Rubusidaeus) 等，草本植物有鴨茅(Dactylisglomerata)、新疆黨參(Codonopsisclematidea)、苦苣菜(Sonchusoleraceus)、野芝麻(Lamiumbarbatum)、早熟禾(Poaspp.)、羊茅(Festucaovina)、麻葉蕁麻(Urticacannabina)和大麻(Cannabissativa)等(李利平等， 2011； 馬闖等， 2018； 張高， 2013)。

1.2 樣地設置

新疆野生蘋果在伊犁河谷地區呈散生或團狀分布，伊犁哈薩克自治州的新源縣、鞏留縣、霍城縣、伊寧縣均有分布，其中新源縣和鞏留縣野生蘋果分布最多且受蘋小吉丁危害最重。故本研究選取目前蘋小吉丁危害最嚴重的庫爾德寧鎮阿勒馬賽(43.23°N，82.85°E)、闊克塔力村(43.25°N, 82.82°E)和七十二團八連(43.24°N, 82.77°E)為采樣地，每個樣地大小為100 m×100 m。

1.3 取樣方法

1.3.1 幼蟲、蛹及坑道取樣方法 在蘋小吉丁幼蟲出蟄危害季節(5—9月)，每5～7天在樣地內隨機選取50個帶蟲枝條(長50 cm，基徑3～6 cm)，帶回實驗室剝取幼蟲、蛹及坑道。由于幼蟲和蛹所處環境大致相同，故把二者合并在一起分析。

1.3.2 成蟲取樣方法 在成蟲羽化高峰期使用捕蟲網捕捉成蟲，隨后將每頭成蟲單獨放入1.5 mL無菌離心管中待用。

1.4 真菌分離與培養

1.4.1 蟲體棲息真菌分離 從受害枝條剝取活體幼蟲和蛹立即置于麥芽提取物瓊脂培養基(麥芽浸粉20 g、瓊脂20 g，去離子水1 000 mL)中，用無菌鑷子使其在培養基上滾動2圈后取出蟲體，于25 ℃恒溫培養箱中培養約1周后，適時挑取不同形態特征的菌落，轉入PDA培養基上進行純化培養和菌種保藏。

將活體成蟲切成5 mm × 5 mm的小塊，用 1.5%次氯酸鈉處理1 min、無菌水漂洗3次，并置于MEA培養基中，于25 ℃恒溫培養箱中培養約1周后，適時挑取不同形態特征的菌落，轉入PDA培養基上進行純化培養和菌種保藏。

1.4.2 坑道棲息真菌分離 小心切下幼蟲取食部位的新鮮韌皮或蛹室木質部組織，將其剪成小塊，立即接種到培養基上，并于25 ℃恒溫培養箱中培養，當組織材料周圍生出菌絲時，挑取形態不同的菌落，轉入 PDA培養基上進行純化培養和菌種保藏。

1.5 菌株 DNA 提取以及目標基因片段的 PCR 擴增及測序

純化菌株在MEA培養基上培養1周后，刮取約1 g菌絲，根據CTAB 法提取純化菌株的DNA，PCR擴增采用ITS1和 ITS4通用引物。擴增產物由上海美吉生物公司測序，序列經BioEdit等軟件進行拼接處理，在NCBI基因庫進行同源性比對分析，確定分類地位。

1.6 數據分析

相對多度(Pi)=某一伴生菌的分離株數/總伴生真菌的分離株數×100%。如果某一真菌類群在群體中的度Pi>1/S，則該類群為優勢菌群，反之，則該類群為次要類群，S為群體中類群總數(Camargo，1992)。

選用Jaccard 指數和Bray-Curtis指數分析不同分離材料之間伴生真菌物種組成的差異性，具體計算過程通過R語言 vegan軟件包中的vegdist函數完成。

另外，選取Shannon-Wiener指數Pielou均勻度和Margalef 豐富度指數來分析物種多樣性。Shannon-Wiener多樣性指數和Pielou均勻度指數具體計算過程通過R語言 vegan軟件包中的diversity函數完成，Margalef 豐富度指數用Excel計算。

2 結果與分析

2.1 蘋小吉丁伴生真菌種類及其數量

共分離得到菌株703株，隸屬真菌57屬(表1)，其中：鏈格孢屬(Alternaria)獲得214株，鐮刀菌屬(Fusarium)97株，殼囊孢屬(Cytospora)55株，小穴殼屬(Dothiorella)49株，其余各屬菌株數量在40株以下。

表1 蘋小吉丁伴生真菌區系組成及數量①Tab.1 The genera composition and the relative abundance of associated fungi with A. mali

在這些真菌類群中，處于優勢地位(相對多度Pi>1/S=1/57)的有10屬(圖1)，所包含菌株數量占總菌株數量的78.13%。其中：鏈格孢屬相對多度最大，其次是鐮刀菌。其余8個優勢屬相對多度在2%～8%范圍內，從大到小依次為殼囊孢屬、小穴殼菌屬、芽枝霉屬(Cladosporium)、莖點霉屬(Phoma)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、亞隔孢殼屬(Didymella)、煙管菌屬(Bjerkandera)，短梗霉屬(Aureobasidium)最小，僅為1.85%。

圖2 不同分離材料伴生真菌的相對多度Fig.2 Relative abundance of the associated fungi from the different isolation materials

圖1 蘋小吉丁伴生真菌優勢屬的相對多度Fig.1 Relative abundance of dominant genera of associated fungi with A. mali

2.2 不同分離材料伴生真菌類群的分布

不同分離每個伴生真菌類群的相對多度如圖2所示。從同一分離材料的所有伴生類群分布看，幼蟲+蛹體表共分離得到菌株151株，隸屬于34屬，鏈格孢屬、芽枝霉屬、殼囊孢屬、亞隔孢殼屬、小穴殼菌屬、鐮刀菌屬、裂褶菌屬和栓菌屬為優勢屬，小穴殼菌屬相對多度最高，為13.91%，其次是鏈格孢屬(13.21%)，再為鐮刀菌屬(11.92%)； 成蟲共分離到菌株328株，隸屬37屬，其中鏈格孢屬、芽枝霉屬、鐮刀菌屬、莖點霉屬為優勢屬，鏈格孢屬相對多度最高，為50.30%，鐮刀菌屬次之(15.85%)，芽枝霉屬(8.23%)在鐮刀菌之后； 坑道共得菌株224株，隸屬40屬，其中鏈格孢、煙管菌屬、殼囊孢屬、亞隔孢殼屬、小穴殼菌屬、鐮刀菌屬、莖點霉屬和栓菌屬為優勢屬，殼囊孢屬相對多度最高，為16.96%，然后是鏈格孢(12.95%)和鐮刀菌屬(12.05%)。由此可見，鏈格孢和鐮刀菌屬在幼蟲+蛹、成蟲和坑道中均大量存在，特別是鏈格孢在成蟲中的相對多度表現的非常突出，高達50.30%。

此外，從真菌類群來看，3種分離材料均具有各自的伴生真菌類群，如細球腔菌屬(Leptosphaeria)、殼滿孢屬(Plenodomus)、臥蠟孔菌屬(Ceriporia)等6屬僅存在于幼蟲+蛹的伴生真菌類群中，黏束孢屬(Graphium)、異擔子菌屬(Heterobasidion)、炭團菌屬(Hypoxylon)等10屬僅存在于成蟲中，隱球殼屬(Cryptosphaeria)、青霉菌屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)等6屬僅存在于坑道中。

2.3 不同分離部位伴生真菌組成的差異性

蘋小吉丁各分離部位除具各自特異性伴生真菌外，還擁有共同伴生真菌類群，如圖3所示。在獲得的57屬伴生真菌中，幼蟲+蛹與坑道共有的伴生真菌為27屬(45.76%)，成蟲與坑道共有的伴生真菌為26屬(45.61%)，幼蟲+蛹和成蟲共有的伴生真菌為20屬(35.10%)，而為上述3種分離部位所共有的伴生真菌達19屬(33.33%)。

另外，Jaccard指數和Bray-Curtis指數反映出的結果是不一致的(表2)，其中：幼蟲+蛹與成蟲的Jaccard相異性指數和Bray-Curtis相異性指數較大，而幼蟲+蛹與坑道的相異性指數均較小。對于Bray-Curtis相異性指數，幼蟲+蛹與成蟲、成蟲與坑道較為接近，都在0.6～0.7之間，但相比幼蟲+蛹與坑道(0.333)差異較大；對于Jaccard指數，幼蟲+蛹與坑道、成蟲與坑道較為接近(0.4～0.5)，但相比幼蟲+蛹與成蟲(0.608)差異較大。綜合分析2種相異性指數發現，幼蟲+蛹和成蟲之間相異性較大，如果只考慮物種的有無，成蟲和坑道的相異性較小(0.490)，而如果不僅考慮物種的有無，而且還考慮不同物種的相對豐度時，成蟲和坑道之間的相異性較大(0.609)。

圖3 不同分離材料真菌類群組成的數量關系Fig.3 Venn diagram of the fungi groups for different isolation materials

表2 不同分離材料之間伴生真菌類群相似性比較Tab.2 Paired comparison of β dissimilarity indices for different isolation materials

2.4 不同分離部位伴生真菌多樣性分析

由坑道分離的伴生真菌Shannon-Wiener多樣性指數最高，幼蟲+蛹體表略低于坑道，成蟲最低，并與前二者相差較大(圖4)。幼蟲+蛹體表伴生真菌類群數量不如成蟲多，但Shannon-Wiener指數卻大于后者，說明前者類群中個體分配上的均勻性(Evenness)較好(圖4)。從Pielou 均勻度指數看，幼蟲+蛹最高，坑道次之，成蟲則明顯低于前二者，說明幼蟲+蛹伴生真菌屬與屬之間個體數量差別不大，而成蟲伴生真菌屬與屬之間個體數量差別較大。而從Margalef豐富度指數來看，三者中坑道最高，成蟲最低。成蟲3種指數均為最低，說明成蟲攜帶真菌種類以少量真菌類群為主。

圖4 不同分離材料之間伴生真菌的多樣性比較Fig.4 Comparison of the diversity of the associated fungi from different isolation materials

3 討論

本文首次系統性研究了蘋小吉丁伴生真菌類群及其多樣性，從蘋小吉丁幼蟲、蛹、成蟲和坑道中共分離鑒定了57屬真菌類群，隸屬于6綱18目。上述57屬中處于優勢地位的有10屬，其中鏈格孢屬的數量最多。盡管不同分離材料伴生真菌分布不同，然而從處于優勢地位的真菌類群及其相對多度來看，鏈格孢屬在幼蟲+蛹、成蟲和坑道中均大量存在，特別在成蟲中相對多度表現非常突出，高達50.30%，可能是因為鏈格孢屬的分生孢子容易釋放，并且通過氣流傳播，在空氣中廣泛存在，蘋小吉丁成蟲喜歡在天氣晴朗、溫度稍高的時候繞樹冠飛行，這為其接觸并攜帶鏈格孢提供了便利條件。鏈格孢主要引起寄主植物葉斑和葉枯病，也可引起果腐病，如蘋果果腐和蘋果果斑(王婧等， 2017； George， 2009)。由于許多鏈格孢屬真菌是腐生真菌，僅在死亡或者正在腐爛的植物組織上生長，因而在一些衰老的葉片、花瓣和成熟的果實上最常見(George， 2009)，但從蘋小吉丁患病幼蟲蟲體上也分離到鏈格孢[細鏈格孢(Alternariatenuis)](孔婷婷等， 2017)，因此，蘋小吉丁和鏈格孢是否復合危害野果樹尚待進一步研究。

鐮刀菌是本研究獲得的另外一個優勢真菌類群，在3種分離材料中均處于優勢地位。在小蠹蟲伴生菌研究中，鐮刀菌與小圓胸小蠹(Euwallaceaefornicatus)形成蟲菌共生體方胸小蠹-鐮孢菌共生體(Euwallacea-Fusarium)(Freemanetal., 2013; O’Donnelletal.， 2016; Kassonetal.， 2013)，造成寄主機械損傷、枝干枯死和木材腐爛(Walgama, 2012)。這些危害狀在受蘋小吉丁危害的樹體上均有表現，并且在害后發生褐變的野生蘋果心材部分也發現了多種鐮刀菌(Chengetal.， 2019)，由此推測蘋小吉丁與鐮刀菌在引起野生蘋果枝枯的過程中均產生了影響。

此外，能引起多種植物潰瘍病的重要真菌類群小穴殼菌屬和殼囊孢屬(張星耀等，1999； 王秀娟等， 2019； 王斌等， 2018)在蘋小吉丁幼蟲+蛹和坑道中大量存在，前者在幼蟲+蛹中表現突出，相對多度最高(13.91%)，后者在坑道中相對多度高達16.96%，因此，不能排除這些真菌類群對野果林產生的危害。與此同時，本研究從蘋小吉丁成蟲中分離到黏束孢屬(Graphium)真菌，該屬許多種類與小蠹蟲形成伴生關系(Jacobsetal.， 2003; Yamaokaetal.， 2009); 但蘋小吉丁成蟲與小蠹蟲生活習性完全不同，前者不進入寄主植物內部生活，僅在補充營養時取食寄主，因此，蘋小吉丁成蟲與該真菌的相互關系還有待進一步探討。

從不同分離部位的伴生真菌數量來看，蘋小吉丁危害的坑道中真菌類群最多，這可能與真菌本身對環境的要求有關，受到創傷的植物組織給真菌的侵入提供了有利條件(葉建仁等， 2011)； 幼蟲+蛹真菌類群最少可能是因為健康的蟲體只允許那些對其有利的真菌類群存在。從Shannon-Wiener多樣性指數分析的結果來看，由坑道分離的伴生真菌Shannon-Wiener 多樣性指數最高，與坑道真菌類群最多相一致，但是幼蟲+蛹體表伴生真菌Shannon-Wiener指數遠遠高于成蟲，前者伴生真菌種類數量不如后者多，但該指數卻大于后者，說明前者伴生真菌種類中個體分配上的均勻性好于后者，也就是說幼蟲+蛹體表伴生真菌屬與屬之間個體數量差別不大，而成蟲伴生真菌屬與屬之間個體數量差別較大，Pielou 均勻質指數的分析結果證實了這一點，同時Margalef 豐富度指數分析結果也與上述結果相一致，三者中坑道最高，成蟲最低。由于上述多樣性指數與地理位置、環境條件及樹木微環境息息相關(王立祥等， 2017)，成蟲3種多樣性指數均最低，而幼蟲+蛹和坑道3種指數相對差異較小，因此推測可能是幼蟲+蛹與坑道微環境相似而與成蟲環境條件相差較大導致。此外，成蟲3種指數均為最低，也說明成蟲攜帶真菌種類以少量真菌類群為主，且主要攜帶真菌種類所占比例在伴生真菌類群中較大。

與此同時，蘋小吉丁上述3種分離材料除擁有共同伴生真菌類群外，各自存在某些特異性較強的真菌種類。幼蟲+蛹和成蟲均與坑道存在共有伴生真菌，說明伴生真菌與坑道環境關系密切(Adamsetal.， 2007)。另外，盡管成蟲和幼蟲相異性較大(Jaccard=0.608，Bray-Curtis=0.683)，但二者共有伴生真菌類群也達20屬，表明雖然幼蟲+蛹和成蟲所生活環境差別較大，但一些真菌類群和蘋小吉丁關系十分密切，可能依靠蘋小吉丁傳播擴散。

4 結論

蘋小吉丁伴生真菌種類較多，且不同分離材料的真菌類群種類和數量存在差異。在這些真菌類群當中，鏈格孢和鐮刀菌是蘋小吉丁整個生活史發育過程中的主要伴生真菌類群，而鐮刀菌的種類常常引起植物枝枯和褐腐，同時，引起植物潰瘍病的重要真菌類群——小穴殼菌屬和殼囊孢屬在幼蟲+蛹和坑道中大量存在，可能存在某些與蘋小吉丁關系十分密切的伴生真菌類群，說明對野果林造成危害的不僅僅是蘋小吉丁，真菌對野果林的衰退也可能產生了較大的影響。因此,對退化野果林生態保育與健康調控要從多個方面考慮，把真菌所致病害和蟲害綜合治理相互結合起來。