長柄雙花木種群遺傳結構及種群歷史*

孟藝宏 徐剛標 盧孟柱,2 姜小龍,3 郭飛龍

(1. 中南林業科技大學林木遺傳育種實驗室 長沙 410004； 2. 浙江農林大學 杭州311300； 3. 中國科學院上海辰山植物園 上海 201602)

遺傳多樣性是生物長期進化的產物。探討生物種群進化歷史，是理解歷史環境因子和人為因素對現實種群地理分布格局、豐富度及進化潛力影響的理論基礎(Cabreraetal., 2017)。我國亞熱帶山區多數原始森林植被是由暖溫帶落葉闊葉林和常綠闊葉林組成，是北半球溫帶植物區系中物種多樣性和特有性程度最高的地區，分布18 000余種種子植物，其中50%～60%為特有種(Wangetal., 2015)，為中國-日本植物區系的核心部分，被認為是古老的植物演化譜系在第四紀冰期的重要避難所，成為全球生物多樣性熱點地區之一(葉俊偉等， 2017)。基于化石孢粉數據重建的植被分布模式(Yuetal., 2000; Nietal., 2010)表明，我國亞熱帶植物在末次冰盛期明顯向南退縮，冰期后從避難所內原地(insitu)周邊經歷局部擴張，在冰期/間冰期的氣候波動過程中，大多數植物可能選擇在多地避難所幸存下來。隨著分子種群遺傳學理論和技術的發展，利用現實種群的遺傳信息推測種群進化歷史、多樣性起源、分布和維持的潛在機制成為可能(Beaumontetal., 2004)。

長柄雙花木(Disanthuscercidifoliusvar.longipes)(2n=16) 系金縷梅科(Hamamelidaceae)雙花木屬(Disanthus)植物(潘開玉等，1994)，為我國特有的第三紀孑遺植物，殘存于南嶺山脈、羅霄山脈及武夷山脈海拔1 300 m以下的常綠闊葉林和針闊葉混交林或矮林中。該物種對生境條件要求苛刻，適宜在溫暖濕潤氣候和酸性土壤上生長，分布區狹窄，種群數量少，已被列為我國Ⅱ級保護植物和珍稀瀕危植物(高浦新等， 2013； 孟藝宏等， 2019)。長柄雙花木為多年生的落葉灌木或小喬木，樹高2～3 m(溪谷兩側的植株可達7 m)，叢生。頭狀花序上對生2朵無梗的兩性花，花序柄細長。自交親和，以昆蟲和風傳播花粉，“花多果少”，種子主要依靠風力傳播(肖宜安等， 2004)。心型葉，互生，葉色由初春綠色變為深秋紫紅色，花、果紅色，觀賞價值高，極具有園林綠化市場的開發利用潛力(廖飛勇， 2010)。作為雙花木屬中國-日本植物區系的替代種，該物種在研究金縷梅科系統發育和東亞植物區系地理演化等方面具有重要的科學價值(高浦新等， 2013)，是探討第四紀冰期以來我國亞熱帶地區植物分布格局及種群遺傳結構時空變化機制的模式植物之一。

有關長柄雙花木種群遺傳學研究較少。現有的研究報道，由于樣本采集于不同的局部區域以及采用不同的標記系統，存在著差異性結論。肖宜安等(2003)基于同工酶標記開展羅霄山脈井岡山地區5個種群遺傳多樣性研究，發現種群遺傳多樣性較高，種群遺傳分化較小； 謝國文等(2014)采用ISSR標記分析南嶺山脈5個種群遺傳多樣性的結果顯示，種群遺傳多樣性偏低，種群間遺傳差異不大； Yu等(2014)采用AFLP標記分析8個種群遺傳多樣性的結果表明，種群維持較豐富的遺傳多樣性，種群遺傳分化明顯。鑒于此，本研究基于熒光SSR標記技術，采集長柄雙花木全分布區12個代表性自然種群，分析其種群遺傳多樣性和遺傳結構，探討現實種群遺傳結構的歷史成因，旨在為該物種遺傳資源保護與開發利用策略的制定提供理論基礎，也為理解我國亞熱帶地區植物多樣性的起源和維持機制提供新證據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017—2018年，參考文獻(高浦新等， 2013)和各地植被本底調查資料，選擇12個長柄雙花木自然種群(表1)，采集嫩葉開展遺傳多樣性研究。為避免采樣個體親緣關系近，盡可能選取同齡級植株(株高3 m左右)，樣株間距20 m以上(徐剛標， 2016)，共采集261個植株的葉片樣本。采集的嫩葉立即放入裝有硅膠的自封袋中，GPS定位采樣點的經緯度和海拔，記錄種群大小及采集的樣本數。葉片樣本帶回實驗室，倒出硅膠后密封，放入-4 ℃冰柜中保存備用。

表1 長柄雙花木采樣信息、樣本量及種群遺傳多樣性參數①Tab.1 Sampling information, sample size and population genetic diversity of D. cercidifolius var. longipes

根據Gao等(2009)和孟藝宏等(2018)開發的長柄雙花木特異SSR引物序列信息，篩選出15對能獲得多態性擴增產物的SSR 引物(表2)。引物由上海Sangon公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取、TP-M13-SSR擴增及基因分型 采用孟藝宏等(2018)改良的CTAB法提取葉片DNA，TP-M13-SSR擴增技術進行熒光PCR擴增，毛細管自動熒光電泳系統ABI 3730XL對擴增產物進行檢測。TP-M13-SSR擴增反應體系與程序，同孟藝宏等(2018)。

采用Gene Marker V4.0(http:∥www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/technical-resources/software-down loads.html)，判讀PCR擴增片段的長度大小。1個峰，視為純合子； 2個峰，視為雜合子。

1.2.2 遺傳參數估算 采用FSTAT2.9.3(http:∥www.bio-soft.net/tree/FSTAT.html)，統計估算種群及位點上的等位基因數(NA)、有效等位基因數(NE)、觀測雜合度(HO)、期望雜合度(HE)，以及種群私有等位基因豐富度(pAR)和種群內近交系數(FIS)(Weiretal., 1984)，并對各位點和種群進行Hardy-Weinberg平衡檢測。

1.2.3 遺傳結構分析 采用FSTAT2.9.3，估算成對種群間遺傳分化系數(FST)(Weiretal., 1984)。

采用STRUCTURE 2.3(http:∥pritch.bsd. ushicago.edu/structure.html)，對所有參試個體進行Bayesian聚類分析。基于種群間等位基因頻率相互獨立(independent allele frequencies)的假設，采用獨立等位基因頻率混合模型(admixture model)，設定類群數(K)為1～12(參試種群數)，Length of Burn-in Period和MCMC均為10 000，每個K值運行12次。根據獨立運行每個K值所獲得的后驗概率lnP(D)，計算ΔK值。ΔK最大值對應的K值視為最合理的類群數(Evannoetal., 2005)。用STRUCTURE 2.3分析參試個體歸屬各類群的比率(Q>0.6)，確定個體歸屬的類群。

采用ARLEQUIN 3.2(https:∥www.softpedia.com/get/Science-CAD/Arlequin.shtml) 中分子方差分析(AMOVA) 選項，估算種群間、種群內遺傳方差分量，10 000次置換，評價統計顯著性。

1.2.4 種群歷史事件推測 采用Bottleneck1.2.02(http:∥www.montpellier.inra.fr/URLB/bottleneck/bottleneck. html)軟件中Wilcoxon單側檢驗法選項，選擇雙相突變模型(two-phased mutation model, TPM)，基于種群雜合度過剩概率，檢測每個種群是否經歷遺傳瓶頸事件。10 000次置換，評價統計顯著性。

2 結果與分析

2.1 長柄雙花木種群遺傳多樣性

15對SSR引物對12個種群261株個體進行TP-M13-SSR擴增，共檢測到129個等位基因。各位點上的等位基因數(NA)為4(DC111)～15(DC115)，平均值為8.6； 有效等位基因數(NE)介于2.00～6.79之間，平均值為3.5。各位點觀測雜合度(HO)和期望雜合度(HE)變動幅度分別為0.11～0.63和0.50～0.85，平均值分別為0.37和0.67(表2)。這表明，各SSR引物檢測出的位點多態性較高，長柄雙花木種內遺傳變異較豐富。Hardy-Weinberg平衡檢驗的結果顯示，所有位點都極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.001)。

種群遺傳參數的統計分析結果(表1)表明，種群中的等位基因數(NA)變異幅度為2.7～4.1，平均值為3.4； 有效等位基因數(NE)為1.74～2.50，平均值為2.1。種群觀測雜合度(HO)均小于期望雜合度(HE)，平均值分別為0.35和0.43。各種群中均有私有等位基因，平均值為0.15，但私有等位基因豐富度(pAR)差異較大(0.06～0.25)。這表明種群遺傳多樣性較豐富。所有參試種群中，井岡山種群(JGS)的各項遺傳參數最大，遺傳多樣性最高，其次為玉山種群(YS)； 湖南莽山種群(MS)除觀察雜合度(HO)外，其他各項遺傳參數最小，遺傳多樣性最低。平均種群內近交系數(FIS)為0.19，除湖南道縣種群(DX)內近交系數為負值(-0.02)，并未顯著偏離Hardy-Weinberg平衡以外，其他種群內近交系數均為正值(0.10～0.40)，呈現出極顯著的不平衡狀況(P<0.001)。

2.2 長柄雙花木種群遺傳結構

FSTAT2.9.3估算的成對種群間遺傳分化系數(FST)見表3。FST為0.169(YS與KH)～0.514(LQ與MS)，平均值為0.354。這表明，在整體上，種群間遺傳分化程度較高。

表3 長柄雙花木成對種群FST的估算值Tab.3 The estimates of pairwise FST for D. cercidifolius var. longipes

基于Bayesian聚類的STRUCTURE 2.2軟件分析的結果顯示，當K=2時，對應的△K值最大，表明長柄雙花木12個種群261株個體的最合理聚類組數為2。K=2情況下，根據每株個體歸屬于各類群的比值(Q)，繪制參試的植株個體歸屬2個類群的比例圖(圖1)。由圖1可知，龍泉(LQ)、開化(KH)、玉山(YS)和井岡山(JGS)種群聚為類群Ⅰ(紅色)，道縣(DX)、莽山(MS)、宜章(YZ)、連州(LZ)、邵陽(SY)、新寧(XN)、宜黃(YH) 和宜豐(YF)種群聚為類群II(綠色)。除宜章(YZ)(4株)、井岡山(JGS)(2株)、邵陽(SY)(2株)、宜黃(YH)(1株)種群中的少數個體(占比3.4%)歸屬于不同類群的Q值小于0.6外，大多數(96.6%)植株個體的譜系清晰。

AMOVA分析結果(表4)表明，長柄雙花木種群內變異分量占總變異的59.67%，種群間遺傳變異占總變異的40.33%，種群間遺傳差異極顯著(P<0.001)。

圖1 STURCTURE分析結果的直方圖(K=2)Fig.1 Histogram of the STRUCTURE analysis for the model with K=2

表4 長柄雙花木種群分子方差分析Tab.4 The molecular variance analysis of populations of D. cercidifolius var. longipes

2.3 長柄雙花木種群歷史

基于雙相突變模型檢測長柄雙花木參試種群近期進化歷史上是否經歷遺傳瓶頸效應的結果(表5)顯示，12個種群均未出現雜合子過剩現象(P>0.05)，所有種群中的等位基因分布模式為正常L型分布(normal L-shaped distribution)，不符合漂移模型(shifted mode)，表明長柄雙花木種群未經歷遺傳瓶頸事件。

表5 長柄雙花木種群遺傳瓶頸效應檢測①Tab.5 Bottleneck detection for D. cercidifolius var. longipes

3 討論

3.1 長柄雙花木自然種群的遺傳多樣性

我國南方地區山脈走向多變，地形復雜，物種多樣性和特有性程度高，是人類活動較頻繁的經濟地理區域，自然生境碎片化較為嚴重(Zhaoetal., 2012)。本研究表明，該區域特有物種長柄雙花木維持較高水平的遺傳變異(表1、表2)，與前人的研究結論(肖宜安等， 2003； Yuetal., 2014)一致，也與基于SSR標記分析我國南方同科植物檵木(Loropetalumchinense)(Yuanetal., 2015)的結果相類似。這表明，近期生境碎片化和遺傳漂變并未對其種群遺傳多樣性產生嚴重影響(Zhaoetal., 2012; Yuanetal., 2015)。

大量研究表明，一些珍稀、特有物種維持較高遺傳多樣性(Geetal., 2003; Zhaoetal., 2012； Turchettoetal., 2016; Soaresetal., 2018)。遺傳多樣性高低與物種的演化歷史、冰期避難所種群的遺傳多樣性維持、分布區的地域特征、物種的生態習性及交配系統等諸多因素有關(Xiaoetal., 2015; Turchettoetal., 2016; Soaresetal., 2018)。長柄雙花木維持較高遺傳多樣性，可能與該物種起源古老、第四紀冰期種群結構相對穩定、現實種群為其避難所殘跡有關(Geetal., 2003; Behlingetal., 2007; Yuetal., 2014)。

本研究中，所有位點都偏離Hardy-Weinberg平衡(表2)。絕大多數(91.7%)種群內近交系數為正值，呈現出極顯著的不平衡狀況，表現為雜合子缺失(表1)，揭示出種群內普遍存在自交或近交(王雁紅等， 2015； Turchettoetal., 2016)，這符合長柄雙花木植株叢生、自交親和的生物學特性。

3.2 長柄雙花木種群遺傳結構和遺傳分化

長柄雙花木遺傳變異主要存在于種群內(59.67%，表4)，與Yu等(2014)的研究結論基本一致。分子方差分析結果中的種群間變異組分(40.33%)與估算的成對種群遺傳分化系數平均值(0.354)相差不大，種群間遺傳分化程度較高。但是，與肖宜安等(2003)和謝國文等(2014)研究得出的種群間遺傳差異較小的結論相反。這可能與前人采集的樣本材料來源于局部區域有關。

植物種群遺傳分化程度受其交配系統、生活史、分布類型、花粉/種子傳播方式及分布范圍、隔離程度及進化歷史等諸多因素影響。長柄雙花木的繁育系統為混合交配系統，小粒種子依靠風力傳播(肖宜安等， 2003)，但種群遺傳分化系數高于基于SSR標記揭示的混合交配系統(0.26)、種子依靠風力傳播(0.13)、特有(0.26)、窄域分布(0.23)的植物種群遺傳分化系數的統計平均值(Nybom， 2004)。這可能與該物種對生境要求特殊以及分布區的地形地貌特征有關。長柄雙花木間斷分布于南嶺山脈、羅霄山脈及武夷山脈，多在空氣濕度大的溝谷、溪流兩旁生長，種群間被走向多樣的高山阻隔。

STRUCTURE分析結果(圖1)表明，長柄雙花木自然種群被聚為2個不同類群，個體譜系清晰，與Yu等(2014) 基于AFLP標記技術的研究結果(南嶺類群和華東類群)基本吻合。

3.3 長柄雙花木種群的歷史事件

更新世期間，我國亞熱帶地區的氣候溫和(Juetal., 2007)，長柄雙花木可能廣泛分布于該地理區域。末次盛冰期(約2.2萬年前)，該地區氣溫比當前低 4～6 ℃，明顯變干(Qiuetal., 2011)，但南嶺山脈、武夷山脈的氣候波動較小(Fengetal., 2016)，可能為該物種生存提供了較適宜的生境條件，成為其避難所。

末次盛冰期以來，長柄雙花木的潛在分布區收縮(孟藝宏等， 2019)，歷史種群中的等位基因分布模型為正常L型分布，沒有經歷遺傳瓶頸事件(表5)，這表明該物種可能遭受末次盛冰期的氣候影響較小。長柄雙花木種群進化歷史過程不符合基于化石孢粉證據揭示的第四紀冰期亞熱帶植物“收縮-擴張”模型(即冰期向低緯度遷移至避難所，間冰期及冰期后向高緯度擴張)(Yuetal., 2000; Nietal., 2010)。這與分布于我國南方的白菊木(Leucomerisdecora) (Zhaoetal., 2012)、甜櫧(Castanopsiseyrei)(Shietal., 2014)、三葉崖爬藤(Tetrastigmahemsleyanum)(Wangetal., 2015)、檵木(Gongetal., 2016)的種群歷史過程相類似。Zhao等(2012)認為，復雜的地形特點，可能會引起植物種群間諸多的地理隔離因素產生，在間冰期種群間仍然保持隔離。自然地理屏障隔離，以及氣候變遷和人類經濟活動造成的生境碎片化，導致種群間遺傳分化加劇，種群規模縮小甚至部分種群趨向滅絕，是長柄雙花木現代地理分布格局和種群遺傳結構的主要成因。

3.4 長柄雙花木遺傳資源保護

長柄雙花木種群間遺傳分化較大(表3、表4)，種群中私有基因較豐富(表1)。因此，保護種群遺傳多樣性，是防止該物種特異種質流失的關鍵，也對維持種群遺傳結構十分重要。目前，該物種的大多數種群分布于自然保護區內，自然生境得到了有效保護，但種群中的幼苗過少，為負增長型結構(繆紳裕等， 2014)。如何采取有效的營林措施促進其種群的自然更新能力，將是今后研究的重點。前期采樣發現，邵陽種群(SY)分布地已被當地政府規劃為旅游區，而新寧種群(XN)的周邊為農田，人為干擾破壞極為嚴重。因此，分布于自然保護區外的種群，建立自然保護小區的工作已顯得迫在眉睫。相對于其他種群，井岡山種群(JGS)和宜豐種群(YF)的遺傳多樣性最為豐富(表1)，應重點開展這2個種群的生境監測和種群生殖生物學特性研究，評估生境碎片化對小尺度種群空間遺傳結構、交配系統的影響。加強長柄雙花木的繁殖生物學特性和人工輔助授粉技術研究，突破其“花多果少”的繁殖瓶頸，對該物種自然種群恢復與重建、人工遷地保育和資源開發利用都尤為重要。

4 結論

近期生境碎片化和遺傳漂移對長柄雙花木種群遺傳多樣性影響較小。長柄雙花木在物種和種群水平上，維持較豐富的遺傳變異，具有較高的進化潛力。種群間的自然屏障，以及氣候變遷和人類干擾導致的種群生境碎片化，是其現代地理分布格局和種群遺傳結構的主要成因。本研究從物種水平上較全面地揭示了長柄雙花木種群遺傳多樣性及遺傳結構特征，可為該物種遺傳資源保護策略的制定提供科學依據。