基于梅花鹿基因組SOLiD測序數(shù)據(jù)鑒定線粒體基因組的異質(zhì)性點變異應(yīng)用

謝留威，李春義，巴恒星※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所吉林省特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)省部共建國家重點實驗室，吉林 長春130112；2.長春科技學(xué)院，吉林 長春130600）

通常情況下，每個哺乳動物細(xì)胞含有大約100個線粒體，每個線粒體有2~10個線粒體DNA（mtDNA）拷貝[1-3]。在沒有組蛋白保護(hù)的情況下，mtDNA是高度易變的，其突變率是核DNA的6~17倍[4]。突變在細(xì)胞線粒體內(nèi)累積，與野生型共存，稱為mtDNA異質(zhì)性。目前，mtDNA異質(zhì)性已成為線粒體遺傳疾病的研究熱點[5]。許多研究認(rèn)為，發(fā)育、衰老和世代演進(jìn)的高頻率mtDNA異質(zhì)性是人類遺傳疾病的核心[6-7]。

對于已知的mtDNA異質(zhì)性突變，基于幾種PCR方法可以確定樣本中的突變位點及其相對頻率[8-11]。然而，對于發(fā)現(xiàn)未知突變，大規(guī)模的高通量測序技術(shù)更適合。但最近研究報道顯示，mtDNA異質(zhì)性檢測正從掃描已知的有限數(shù)量突變轉(zhuǎn)變?yōu)槿€粒體基因組篩查[12-13]。

ABI SOLiD測序平臺使用短讀長（35~75 bp），通過一種顏色編碼框架（color space），測序不同堿基之間顏色信號。每一個測序堿基都依賴于2個連續(xù)的顏色編碼值，當(dāng)短讀長與參考基因組比對后，如出現(xiàn)測序錯誤（即單色差異）就可以與正確的堿基變化區(qū)別分開，這為重測序研究提供了新的非常具有優(yōu)勢的判定方法。這種獨特的編碼方式具有前后堿基校對功能，使堿基測序準(zhǔn)確率高達(dá)99.94%[14]。本研究通過對一只雄性梅花鹿血細(xì)胞全基因組SOLiD測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，檢測mtDNA基因組中異質(zhì)性突變，以期為充分利用SOLiD全基因組測序數(shù)據(jù)鑒定未知的mtDNA異質(zhì)性點變異提供基本生物信息分析框架。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

利用ABI SOLiD測序平臺對一只雄性梅花鹿血細(xì)胞進(jìn)行全基因組雙末端測序，讀段長度為50 bp。另外，從GenBank中下載與全基因組測序梅花鹿屬于同一亞種的mtDNA全長序列（登錄號：KX689229）作為SOLiD測序數(shù)據(jù)比對的線粒體參考序列。

1.2 分析方法

低頻變異檢測需要高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，過濾掉包含未知堿基或平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于20的讀段。使用PerM v0.4軟件[15]，選項設(shè)置為“-A-E-seed F4-V5-L400-e”，將高質(zhì)量的讀段與mtDNA參考序列進(jìn)行比對。在許多真核生物中，mtDNA經(jīng)常被轉(zhuǎn)移到核基因組中，產(chǎn)生了核線粒體假基因序列（nuclear mitochondrial DNA segments，NUMTs）。不同大小NUMTs片段與mtDNA序列存在高度差異[16-17]。根據(jù)NUMTs高變異率的特點，排除包含大于5個不匹配顏色值，相當(dāng)于2~3個不匹配堿基（相似度≥94%）的讀段。由于NUMTs平均長度為240 bp[18]，SOLiD成對末端測序文庫的平均雙末端長度為831 bp（圖1），這可以在一定程度上減少NUMTs的影響，同時去掉單端映射讀段。最后，利用Samtools v1.2[19]中的mpileup工具和Bcftools v1.3.1軟件[20]聯(lián)合檢測mtDNA異質(zhì)性點變異，在Tablet v1.18軟件中對點變異可視化顯示。

圖1雙末端長度分布Fig.1 Insert size distribution

2 結(jié)果與分析

2.1 比對結(jié)果

過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，共獲得410 662 782（38 Gb）成對短讀段，相當(dāng)于全基因組測序深度約13（38 Gb/3 Gb）。大約0.035%的成對讀段比對到mtDNA參考序列，覆蓋率為99.62%，在2 265~2 329（65 bp）區(qū)域未被短讀段覆蓋（圖2）。線粒體基因組的平均測序深度約為892，一方面表明血細(xì)胞中mtDNA的拷貝數(shù)較高，另一方面表明部分源于NUMTs的讀段被比對。然而，動物中NUMTs的總量約為核基因組的0.1%。在梅花鹿基因組中，NUMTs的比例（0.035%）相對較低，表明高度可變的NUMTs讀段被排除掉，這進(jìn)一步提高了鑒定mtDNA異質(zhì)性點突變的準(zhǔn)確性。

圖2 mtDNA上2 265~2 329（65 bp）區(qū)域未被短讀段覆蓋Fig.2 mtDNA region 2 265-2 329（65 bp）uncovered by short reads

2.2 mtDNA異質(zhì)性點變異鑒定

本研究共檢測到8個點突變（圖3），包括4種轉(zhuǎn)換和4種顛換（表1）。其中，5個點突變位于蛋白質(zhì)編碼基因（COX1、COX2、ND4和ND5），2個位于tRNASer，1個存在于12SrRNA中。為了驗證NUMTs讀段是否影響點突變的鑒定，通過檢索GenBank中18個梅花鹿線粒體全基因組中相應(yīng)位點的變化，證實這8個點突變都存在于18個mtDNA基因組中（表1），表明它們是mtDNA特有的單核苷酸多態(tài)位點，而不是由NUMTs引入的。重要的是，C6180T、T7481A和A10909T這3個位點分別導(dǎo)致氨基酸的變化，即：絲氨酸（Ser）脯氨酸（Phe）→亮氨酸（Leu）→脯氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）→谷氨酰胺（Gln）。mtDNA異質(zhì)性點突變的選擇性壓力與組織特異性代謝率、細(xì)胞周期和生物能量需求有關(guān)[18]，這暗示梅花鹿不同類型的血細(xì)胞可能承受不同的選擇壓力。

圖3 8個mtDNA異質(zhì)性點突變可視化比對Fig.3 Visual comparison of 8 mt DNA heteroplasmic point variations

3 結(jié)論

目前，盡管SOLiD測序平臺已不常用，但其已產(chǎn)生大量原始基因組測序數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)仍然具有較高的科學(xué)價值，特別是SOLiD平臺對測序堿基進(jìn)行顏色編碼校對特性，在利用重測序進(jìn)行點變異檢測方面具有固有優(yōu)勢。本研究通過生物信息學(xué)分析方法充分挖掘一只雄性梅花鹿血細(xì)胞全基因組SOLiD測序中短讀長數(shù)據(jù)，在mtDNA基因組中鑒定了8個異質(zhì)性點突變，將為利用全基因組測序數(shù)據(jù)鑒定未知的mtDNA異質(zhì)性點變異提供一個基本分析框架。