超高效液相色譜-串聯質譜法測定桃中春雷霉素殘留量

劉 煒 ，劉 行 ，楊曉鳳 ，尹 全 ，毛建霏 ，張義蓉 ，陳龍飛

（1.四川省農業科學院分析測試中心，四川成都610066；2.四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所，四川成都610300）

春雷霉素是放線菌產生的代謝產物，屬氨基糖苷類抗菌素，分子式為C14H25N3O9[1]，1963 年從日本奈良縣春日神社的土壤中分離出第一株鏈霉菌，我國的春雷霉素產生菌是1964 年在江西土壤中分離出的小金色鏈霉菌[2-3]。春雷霉素是農學、醫學兩用抗生素類殺菌劑，具有較強的滲透性和內吸性[4]，主要是通過抑制病菌菌體的蛋白質合成，抑制菌絲伸長并導致細胞顆粒化，干擾病菌在農作物植株內生長繁殖，從而達到防治病害的目的，對防治西瓜、黃瓜、桃、番茄、馬鈴薯、水稻等多種農作物的細菌、真菌病害有效[5-7]，作為高效、廣譜、低毒、無公害生物農藥，急性毒性較低，是較理想的殺菌劑。日本和歐盟規定春雷霉素在水果中最大殘留限量值均為0.2 mg/kg[8]。

春雷霉素因具有極性強、在水中溶解度大、無紫外吸收特性，在液相色譜柱上保留能力弱，與雜質不能完全分離，分析檢測難度大[9]。目前，春雷霉素的檢測方法還沒有國家和行業標準，雖然在水、土壤、黃瓜、糙米、農藥制劑等樣品中春雷霉素的檢測方法[10-17]已有相關文獻，但在桃中春雷霉素的殘留分析方法尚未見報道。

本研究以桃為試驗對象，建立了超高效液相色譜- 串聯質譜測定桃中春雷霉素殘留的分析方法，可滿足桃中春雷霉素殘留的檢測要求，為春雷霉素的科學使用以及在食品中的殘留分析和風險評估提供重要依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試桃購買于農貿市場。

1.2 試劑

春雷霉素標準品（純度≥98%，德國Dr. E 公司）；甲醇、乙腈（LCMS 級，德國 Merck 公司）；甲酸（HPLC 級，上海安譜實驗科技股份有限公司）；氯化鈉（分析純，四川西隴化工有限公司）；超純水。

1.3 主要儀器與設備

超高效液相色譜- 串聯質譜儀，配電噴霧電離源（ESI）（Waters XEVO TQ-XS，美國 Waters 公司）；JA3003 分析天平（萬分之一天平，上海精密科學儀器有限公司）；高速勻漿機（T18 ULTRA-TURRAX，德國 IKA 公司）；高速離心機（Neofuge 18R，香港力康生物醫療科技控股集團）；超純水儀（UPL-1-100L，四川優普超純科技有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 標準溶液的配制 準確稱取10.0 mg 春雷霉素標準品至10 mL 的棕色容量瓶中，超純水定容，得到1 000 mg/L 的標準儲備溶液，存放于-18 ℃冰箱中。臨用前，根據需要將其稀釋成不同濃度的標準工作液。

1.4.2 桃前處理 稱取5.00 g 均質桃樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 1.0%甲酸的甲醇溶液高速勻漿1 min，于8 000 r/min 下離心5 min，后吸取上清液于50 mL 離心管。殘渣中加入10 mL 1.0%甲酸的甲醇溶液，高速勻漿1 min，8 000 r/min 下離心5 min，吸取上清液，并且合并2 次上清液，加入5 g NaCl，振蕩1 min，吸取1.0 mL 上清液過0.22 μm 有機濾膜，濾液用于高效液相色譜- 串聯質譜檢測春雷霉素。

1.4.3 液相色譜- 串聯質譜條件

1.4.3.1 液相色譜條件 色譜柱Waters ACQUITY UPLCBEH Amide Column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；樣品室的溫度15 ℃；流動相為乙腈溶液∶0.2%甲酸水溶液＝60∶40（V/V）；流速0.3 mL/min；進樣體積 1.0 μL。

1.4.3.2 質譜條件 離子源為電噴霧電離，正離子模式（ESI+）；毛細管電壓 3.0 kV；錐孔電壓 40 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑溫度600 ℃；脫溶劑氣流量1 000 L/h；錐孔反吹氣 150 L/h。多反應監測（MRM）模式下，以保留時間和離子對信息比較進行定性分析，以母離子和響應值最高的子離子進行定量分析（表1）。

表1 春雷霉素質譜條件

1.4.4 標準曲線制作 準確移取春雷霉素儲備液，并依次稀釋，配制成 10、20、40、100、200、400、1 000 μg/kg 的基質匹配標準溶液，在1.4.3 的液相色譜- 串聯質譜條件下進行測定，以標準工作溶液的質量濃度對應各組分色譜峰面積作圖，繪制線性關系曲線。

1.4.5 添加回收率測定 采用空白桃樣品，進行加標水平為 10、100、200 μg/kg 的回收率試驗，每個加標水平重復測定7 次，測定回收率及相對標準偏差。采用向空白樣品中逐級降低加標濃度，在較低濃度下且春雷霉素峰形較好時，以信噪比S/N＝3，計算方法的檢出限，信噪比S/N＝10 時，計算方法的定量下限（LOQ）。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的確定

考察了甲醇溶液、乙腈溶液、0.1%甲酸- 甲醇溶液、0.5%甲酸- 甲醇溶液、1.0%甲酸- 甲醇溶液、0.1%甲酸- 乙腈溶液、0.5%甲酸- 乙腈溶液、1.0%甲酸- 乙腈溶液對桃樣品中春雷霉素提取效果的影響，發現1.0%甲酸- 甲醇溶液提取效果最好，回收率達到92.1%，故確定1.0%甲酸- 甲醇溶液為提取溶劑。

2.2 色譜條件的確定

春雷霉素極性大，在反相C18 色譜柱上沒保留，考慮采用對極性化合物保留作用較強的親水色譜柱，比較了Waters ACQUITY UPLC BEH Amide Column 和Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC Column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）2 種色譜柱的分離效果，結果發現，在相同色譜條件下，春雷霉素在Waters ACQUITY UPLC BEH Amide Column 色譜柱上保留能力較好。進一步考察了乙腈- 水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液作為流動相時對春雷霉素色譜峰的影響，綜合考慮峰形、保留時間、分離度和靈敏度，發現乙腈-0.2%甲酸水溶液作為流動相時效果較好。當流動相乙腈與0.2%甲酸體積比為60∶40 時，春雷霉素的色譜峰峰形對稱尖銳，且與雜質分離較好，保留時間2.84 min（圖1）。故最終采用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide Column 色譜柱，流動相為乙腈∶0.2%甲酸＝60∶40（V/V）進行等度洗脫分離。

2.3 方法的線性關系分析

在10～1 000 μg/kg 范圍內，春雷霉素的質量濃度與峰面積呈良好的線性關系，線性回歸方程為：Y＝5.11×105X－1.80×103，相關系數為 0.999。采用向空白樣品中逐級降低加標濃度，在較低濃度下峰形較好時，以信噪比S/N＝3 計算得出方法的檢出限（LOD）為 3.0 μg/kg，信噪比 S/N＝10 計算出方法的定量下限（LOQ）為10.0 μg/kg。

2.4 春雷霉素在桃基質中添加回收率和精密度分析

在空白桃中按照 10、100、200 μg/kg 添加春雷霉素標準品，每個濃度7 次平行，測定回收率及相對標準偏差。結果表明，在10～200 μg/kg 添加水平范圍內，添加回收率為86.2%～91.0%，相對標準偏差（RSD）為 2.2%～4.5%（表2），符合春雷霉素殘留分析要求。

表2 春雷霉素殘留回收率和和精密度（n＝7）

2.5 實際樣品測定分析

應用所建立的方法對市售的100 份樣品進行春雷霉素殘留的測定，結果發現，5 份樣品檢出含量值分別為 0.013、0.018、0.054、0.068、0.130 mg/kg，參照日本和歐盟規定的水果中春雷霉素的最大殘留限量值，其殘留均未超出最大殘留限量值。

3 結論

本試驗所建立的方法中，春雷霉素在10～1 000 μg/kg 的范圍內線性關系良好，相關系數為0.999；在添加水平為 10、100、200 μg/kg 時，平均添加回收率分別為86.2%、91.0%、89.5%，相對標準偏差（RSD）分別為 2.2%、3.7%、4.5%，方法檢出限為3.0 μg/kg，定量限為 10.0 μg/kg。本試驗通過色譜及質譜條件的優化，建立了超高效液相色譜- 串聯質譜測定桃中春雷霉素殘留的分析方法，該方法快速、簡便、準確，可滿足桃中春雷霉素殘留檢測的要求，為春雷霉素的科學使用以及食品中春雷霉素的殘留分析和風險評估提供重要依據。