廢棄胚胎（D3）繼續培養至囊胚的過程中與胚胎細胞數目的關系

柴娟 包云( 通訊作者) 劉鴻 師帥 鄭群 鄒立波 毛佳婷

( 金華市人民醫院生殖中心 浙江 金華 321000)

在輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）中多胎妊娠率與移植胚胎的數目是密不可分的，即兩者之間存在著正相關的關系。近十年來，隨著分子生物學檢測技術的發展和完善，臨床著床率有了顯著的提高，同時單囊胚的妊娠率也保持較高的水平[1-2]。因此，與十多年前相比多胎妊娠率有了很大的改善[3]。然而，即使移植兩個胚胎也會導致雙胎出現的可能性，這就大大的加重了母親和孩子的危險性。例如，雙胎大腦的發病率是單胎的七倍之高[4]。因此單囊胚移植越來越被提倡，然而在實際操作中，有許多原因導致患者在第三天沒有胚胎可用?；谝陨显颍狙芯康哪康脑谟谔接懙谌鞆U棄胚胎在輔助生殖中作用，從而增加冷凍和移植的囊胚數目，以提高不育夫婦懷孕的機會；并探討廢棄胚胎的細胞數目與囊胚形成之間的關系，從而為挑選優質胚胎進行移植提供依據。

1.資料與方法

1. 一般資料

收集2016 年10 月—2018 年在金華市人民醫院行第三天胚胎繼續培養826 名患者共8209 個廢棄胚胎的資料，進行回顧性分析。

1.2 治療方法回顧

（1）胚胎繼續培養技術：采用Vitrolife 序貫培養液將廢棄胚胎（2PN、1PN 和0PN）培養至第五天或第六天，并在D5 或D6 早上進行囊胚評估。

（2）囊胚激光打孔技術：將D5 和D6 形成的可用囊胚行激光法，即遠離內細胞團的位置，選擇滋養層較薄處進行激光處理，通常在5 分鐘內囊胚腔完全皺縮。

（3）囊胚冷凍技術：采用加藤試劑，對可用囊胚進行玻璃化快速冷凍。

1.3 胚胎評價標準及觀察指標

（1）D3 胚胎評價標準：D3 胚胎細胞數目：分為＜7細胞、 7 ～9 細胞（7 細胞、8 細胞以及9 細胞）、＞9細胞。

（2）形成囊胚評價標準：形態評定基于Gardner 法，同時評定囊胚擴張程度以及內細胞團（ICM）和滋養外胚層（TE）的發育情況。將優質（3AA、4AA、5AA、3AB/BA，4AB/BA 和5AB/BA）和中等質量（3AC/BC/CA/CB，4AC/BC/CA/CB 和5AC/BC/CA/CB）的第五/六天擴張囊胚進行玻璃化冷凍保存，而低質量囊胚（3CC，4CC 和5CC）則被排除和丟棄。

（3）觀察指標：比較不同D3 胚胎細胞數目的囊胚形成率、可用囊胚形成率、優質囊胚形成率。

1.4 統計學方法

數據分析使用SPSS20.0 統計學軟件，用均數±標準差（±s）表示計量資料，各組間的統計分析采用t分析，計數資料以（%）表示，行卡方檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 廢棄胚胎囊胚培養的結果

將826 名患者共8209 個廢棄胚胎進行延續培養至D5/D6，共形成1371 個囊胚，總囊胚形成率為16.7%（1371/8209），總可用囊胚形成率為14.83%（1218/8209），總優質囊胚形成率為11.57%（950/8209）。

2.2 分析各因素與囊胚形成率的關系

（1）將年齡分為三個階段，即＜30歲、30～34歲及＞34歲，各年齡組總囊胚形成率、優質囊胚形成率，中等質量囊胚形成率和棄去囊胚率有一定的差異，但是無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 患者年齡與囊胚形成率[n（%）]

（2）將形成的可用囊胚按細胞數分組，即細胞數＜7、7 ～9 細胞及＞9 細胞組，7 ～9 細胞的囊胚形成率和＞9 細胞組明顯高于細胞數＜7，差異有統計學意義（P＜0.05）；7 ～9 細胞組比＞9 細胞組的囊胚形成率高，但是差異無統計學意義，見表2。

表2 患者形成囊胚與胚胎細胞數目的關系

（3）分析具體細胞數目，即7 細胞組、8 細胞組及9 細胞組，8 細胞組的囊胚形成顯著高于7 細胞組和9 細胞組，差異有統計學意義（P＜0.05），7 細胞組和9 細胞組的囊胚形成率有一定的差異，但是無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 患者形成囊胚與胚胎具體細胞數目的關系

3.討論

眾所周知，胚胎的質量是影響臨床結局的重要因素。然而在實際的在體外受精-胚胎移植治療不孕患者的過程中，有很多病人由于第三天沒有優質胚胎或可用胚胎而放棄移植。根據現有的發表文獻來看，新鮮低質量胚胎的植入潛力到底如何至今尚無定論[5-6]。一些學者提出卵裂階段的胚胎質量與其植入潛力相關，而另一些學者則表示形態學參數較差并不妨礙移植的成功[7]。低質量的卵裂期胚胎是否值得冷凍的問題同樣繼續存在著類似的爭議。

此外，目前在輔助生殖治療的過程中有很多被評為IV 級的胚胎被放棄。研究表明，僅有31.2%胚胎被利用[8]。如果將這些評分低的胚胎進行加以利用，那么胚胎的利用率和累計妊娠率將會得到提高。同時研究表明將IV 級胚胎繼續培養最終可以形成囊胚[9]，囊胚是胚胎體外培養的終末階段，也是很重要的環節。除此之外，研究表明與移植胚胎相比，囊胚移植可以提高胚胎種植率和臨床妊娠率[10]。我們研究了本中心826 名患者共8209枚被丟棄的胚胎，將其繼續培養至D5/D6 天，結果共形成1371個囊胚，總囊胚形成率為16.7%，總可用囊胚形成率為14.83%，總優質囊胚形成率為11.57%。因此將一些評分低的胚胎、非正常受精的胚胎（1PN 和0PN）繼續培養，可以最大限度地利用胚胎，提高囊胚的冷凍和移植數目，減少患者的損失。

年齡可能是影響囊胚形成的主要因素[11]。我們本次研究單因素分析發現各年齡組（＜30 歲、30 ～34 歲及＞34 歲）總囊胚形成率、優質囊胚形成率，中等質量囊胚形成率和棄去囊胚率有一定的差異，但是無統計學意義。可能與我們收集的胚胎的質量有著很大的關系，我們主要是研究第三天被丟棄的胚胎的成囊率的情況，這一結果也說明了年齡可能不是影響廢棄胚胎成囊率的主要因素；其次還可能與我們收集的樣本數目有一定的關系，＞34 歲組患者的胚胎數目較少造成了一定的偏奇。

目前對于胚胎的評級大部分仍然使用胚胎形態學評分系統，其中細胞數目作為一個重要的參數指標。正常的胚胎發育為第1 天2 細胞，第2 天4 細胞，第三天8 細胞。然而在實際胚胎發育的過程中并不是每個胚胎都能進行正常發育，因此，我們本次將廢棄的胚胎按細胞數目進行分組（細胞數＜7、7 ～9 細胞及＞9 細胞組）。結果表明7 ～9 細胞和＞9 細胞組的囊胚形成率明顯高于細胞數＜7，差異有統計學意義；7 ～9 細胞組比＞9 細胞組的囊胚形成率高，但是差異無統計學意義。這一結果提示我們在選擇移植第三天的胚胎時優先考慮接近8 細胞的胚胎，其次選擇＞9 細胞的胚胎。此外，按照胚胎正常的發育情況，第三天理想的細胞數目是8 細胞，而7 和9 細胞最為接近。那么在沒有8 細胞的情況下優先選擇7 細胞還是9 細胞進行移植仍然有一定的爭議。因此我們研究了廢棄胚胎7 細胞、8 細胞以及9 細胞的成囊率，結果表明8 細胞組的囊胚形成顯著高于7細胞組和9 細胞組，差異有統計學意義，7 細胞組和9 細胞組的囊胚形成率有一定的差異，但是無統計學意義。這一結果提示我們在囊胚形成過程中7 細胞和9 細胞并無大的差異，在移植第三天胚胎時針對同等級的7 細胞和9 細胞可能并無大的差異。

綜上所述將患者第三天評分低的胚胎進行繼續培養，可以增加囊胚的冷凍和移植數目。在第三天同等級的胚胎中，可優先選擇接近8 細胞胚胎進行移植，其次是＞9 細胞的胚胎。同時將評分低的胚胎繼續培養至囊胚期，不僅能夠改善低質量卵裂胚全部被遺棄的現狀，同時也為無可用胚胎和卵裂胚移植失敗的患者提供第二次臨床妊娠的機會，降低重復治療周期的數目，這在臨床上具有一定的意義。