原核表達IBDV VP5基因同源dsRNA方法的建立

季剛，俞天奇，張宜娜，周繼勇，胡伯里*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095；2. 浙江大學動物醫(yī)學系/農(nóng)業(yè)部動物病毒學重點實驗室，浙江 杭州 310058)

傳染性法氏囊病(infectious bursal disease， IBD)是一種具有高度傳染性，免疫抑制性的疾病，病原體主要通過損害雞的免疫器官法氏囊從而引起雞的發(fā)病死亡。傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的基因組由兩個片段A和B組成，A片段編碼4個蛋白，分別是衣殼蛋白VP2、支架蛋白VP3、具有水解酶活性的蛋白VP4以及非結構蛋白VP5[1-4]；B片段只編碼VP1蛋白，該蛋白具有RNA聚合酶的功能。VP5蛋白與病毒毒力的強弱密切相關，研究其功能有助于更好地了解病毒復制全過程。RNA干擾技術可阻斷靶基因的表達進而阻斷蛋白的表達，利用其研究蛋白功能，獲得能使目的基因降解的dsRNA是實施RNA干擾技術的前提。

目前，在研究基因功能的過程中，相應基因的dsRNA主要是通過商業(yè)化的試劑盒合成。雖然該方法能獲得基因dsRNA，但合成過程中所需的經(jīng)濟成本以及大量時間的耗費限制了dsRNA的大批量生產(chǎn)，制約了對其功能的研究。而在異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-B-thiogalactoside，IPTG)的誘導下，利用大腸桿菌HT115(DE3)可以大量合成dsRNA,且可以顯著降低成本[5]。本文通過構建帶有目的基因VP5的RNA干擾載體，利用IPTG誘導大腸桿菌HT115(DE3)表達并合成IBDV-VP5-dsRNA，為進一步研究VP5基因功能打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 RNA干擾載體

L4440質(zhì)粒，由中國林業(yè)科學研究院資源昆蟲研究所楊璞老師贈送；反向遺傳質(zhì)粒pcdna 3.0-A，由本實驗室保存。

1.2 菌株

大腸桿菌HT115(DE3)型菌株，由中國農(nóng)業(yè)大學昆蟲學系和農(nóng)業(yè)部有害生物監(jiān)測與綠色防控重點實驗室沈杰老師饋贈。

1.3 主要試劑

AceQ qPCR Probe Master Mix、Hiscript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、2×taq plus master mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)，四環(huán)素(Tet)、溶菌酶(上海生工生物工程有限公司)，質(zhì)粒提取試劑盒(TIANGEN公司)，DNA純化回收試劑盒、PCR清潔回收試劑盒(AXYGEN公司)，核酸Marker (TaKaRa公司)，Trizol(上海普飛公司)等。

1.4 dsRNA合成引物的設計

目的基因的上游引物的5′端和下游引物3′端分別加上NheⅠ、XbaⅠ酶切位點。

1.5 重組載體L4440-IBDV-VP5的構建

1.5.1 目的片段的克隆與回收

使用phanta Max Super-Fidelity DNA酶，以pcdna3.0-A載體為模板，用表1中的有關引物進行PCR反應,延伸時間設置為30 s，35個循環(huán)反應。反應結束后將PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在紫外燈下切取凝膠，參考DNA凝膠回收試劑盒方法回收DNA片段，測完濃度后并將回收產(chǎn)物置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 dsRNA合成引物和重組質(zhì)粒鑒定引物

1.5.2 膠回收產(chǎn)物與L4440載體酶切、連接、轉(zhuǎn)化

利用NheⅠ、XbaⅠ37 ℃過夜酶切質(zhì)粒與膠回收片段，使用T4連接酶進行連接反應，按照相應的比例在16 ℃下連接4 h。從-80 ℃冰箱中取HT115(DE3)感受態(tài)細胞并迅速放入冰上，待感受態(tài)細胞融化后，吸取10 μL連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中，用移液器輕輕吹打使其混勻，并將其放置冰上冰浴30 min。隨后，將其再放入42 ℃水浴鍋中熱激90 s，熱激后迅速置于冰上2～3 min。加入無抗的LB液體培養(yǎng)基，混勻后放入37 ℃搖床培養(yǎng)2 h，低速離心，棄掉部分上清。將菌體重懸后涂布于含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的LB平板上，將平板倒置放于于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h。

1.5.3 陽性克隆的篩選

待平板上長出細菌后，挑取7個單菌落放于裝有1 mL的含有四環(huán)素抗性的LB培養(yǎng)基中，并放入搖床培養(yǎng)2 h，分別利用表格1中的上下游引物test-F、test-R菌液PCR鑒定。菌液PCR程序參考1.5.1中的反應程序。反應結束后在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，通過觀察條帶大小，500 bp左右即為正確條帶。在超凈工作臺中吸取部分菌液送與公司測序，剩余菌液保存于4 ℃?zhèn)溆?。待測序正確后，擴大培養(yǎng)菌液并參照質(zhì)粒小提中量試劑盒(TIANGEN)說明書進行質(zhì)粒提取。

1.6 IBDV-VP5-dsRNA的誘導表達

取過夜培養(yǎng)的菌液，將其按照1∶500比例接種于100 mL的含有氨芐和四環(huán)素抗性的LB液體培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)基放入37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h左右，至菌液呈現(xiàn)云霧狀即細菌達到對數(shù)生長期時，吸取1 mL菌液放入EP管中作為誘導前菌液備用，在剩余培養(yǎng)基中加入經(jīng)過無菌處理的終濃度約為0.4 mmol/L的誘導劑IPTG，繼續(xù)放入37 ℃振蕩培養(yǎng)4～5 h。收集菌液并以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，收集菌體，將收集到的菌體用濃度為500 mg/mL的溶菌酶常溫裂解10～20 min，并用Trizol法提取dsRNA，dsRNA用高壓過后的DEPC處理水溶解，并從溶解液中取出少量測定其濃度。最后，用降解DNA(DNaseI)和降解單鏈RNA(RNaseA)消化處理1 h，以獲得較純的dsRNA，并進行電泳檢測。

1.7 dsRNA原核表達條件的優(yōu)化

分別于對數(shù)生長期添加不同量的IPTG，使其終濃度分別為0.2 mmol/L、0.4 mmol/L和0.6 mmol/L，繼續(xù)誘導4 h，取樣提取dsRNA。分別于對數(shù)生長期放入16 ℃、37 ℃繼續(xù)誘導4 h，取樣提取dsRNA。分別于對數(shù)生長期，誘導0、1、2、3、4、5、6、7 h，提取dsRNA。通過RT-qPCR檢測dsRNA相對表達量，確定最佳表達條件。以U16S為作標準化的內(nèi)源對照。U16S引物的序列為：U16S正向，5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′和U16S反向，5′-TATTACCGCGGCTGCTGGC-3′。dsRNA引物序列為：IBDV-VP5正向，5′-GTCAGTAGAGATCA-3′和IBDV-VP5反向，5′-ATGACAAACCTGCAAGATCA-3′。

2 結果與分析

2.1 目的基因的克隆

以本實驗室保存的含有傳染性法氏囊病毒A片段全長的反向遺傳質(zhì)粒pcdna 3.0-A為模板，進行目的片段的擴增，獲得500 bp左右片段，如圖1所示。

M.Marker；1.帶有酶切位點的VP5片段圖1 目的基因的克隆

2.2 重組載體L4440-IBDV-VP5的鑒定

隨機挑取7個單菌落進行菌液PCR鑒定，陽性克隆產(chǎn)物應為500 bp左右(圖2)，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果與預期片段大小基本相符，菌液測序結果也正確。

M.Marker；1～7.克隆載體菌液PCR鑒定；8.陰性對照圖2 重組載體L4440-IBDV-VP5菌液PCR鑒定

2.3 原核誘導HT115(DE3)表達IBDV-VP5-dsRNA

將在IPTG誘導前后收集的菌液低速離心，得到的菌體用溶菌酶處理后，用Trizol法提取細菌總RNA。將提取產(chǎn)物經(jīng)DNaseI(單鏈或雙鏈DNA)和RNaseA(單鏈RNA)消化處理后分別通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。已知目的基因VP5的長度約為500 bp，經(jīng)IPTG誘導的菌液能夠表達出相應大小的dsRNA，且未經(jīng)誘導的菌液未能表達出dsRNA，結果如圖3所示。

M.Marker；1.IPTG誘導前提取的dsRNA；2.IPTG誘導后提取的dsRNA；3. 經(jīng)DNaseI、RNaseA處理后的dsRNA圖3 dsRNA的誘導表達

2.4 dsRNA原核表達條件的優(yōu)化

2.4.1 不同IPTG濃度對dsRNA誘導表達產(chǎn)量的影響

分別于對數(shù)生長期(OD600=0.6)添加不同量的IPTG，使其終濃度分別為0.2、0.4和0.6 mmol/L，繼續(xù)誘導4 h，隨后提取dsRNA并通過RT-PCR檢測dsRNA相對表達量。由圖4可以看出，不同濃度的IPTG對于dsRNA 表達量有不同的作用，dsRNA的表達量隨著IPTG濃度的增高而增高。當IPTG終濃度為0.6 mmol/L的左右，dsRNA的表達量相對較高，但差異不顯著(P>0.05)。

圖4 不同IPTG濃度對dsRNA誘導表達產(chǎn)量的影響

2.4.2 不同誘導時間對dsRNA表達量的影響

分別于對數(shù)生長期(OD600=0.6)添加終濃度為0.6 mmol/L的IPTG，在37 ℃分別誘導0、1、2、3、4、5、6、7 h后，提取dsRNA并通過RT-PCR檢測dsRNA相對表達量，得到不同誘導時間與dsRNA誘導表達產(chǎn)量的關系。由圖5可以看出，誘導時間對于dsRNA表達量是有影響的，隨著誘導時間的延長，dsRNA的表達量先增大后減少。當誘導時間為5 h時，dsRNA的表達量相對較高。

圖5 不同誘導時間對dsRNA表達量的影響

2.4.3 不同誘導溫度對dsRNA表達量的影響

分別于對數(shù)生長期(OD600=0.6)添加同量的IPTG，使其終濃度為0.6 mmol/L，分別在16 ℃和37 ℃誘導5 h后，提取dsRNA并通過RT-PCR檢測dsRNA相對表達量，得到不同誘導溫度對dsRNA誘導表達產(chǎn)量的關系。不同誘導溫度對于dsRNA表達量是有影響的，在相同IPTG 濃度下，當誘導溫度為37 ℃時，dsRNA的表達量相對較高。

綜上，針對該菌株，當IPTG誘導終濃度為0.6 mmol/L，在37 ℃誘導5 h，dsRNA相對表達量最高。

3 討論

RNA干擾技術可以高效沉默同源mRNA[6-8]，進而阻斷靶基因的表達[9-10]，是研究基因功能的有效方法[11-13]，而dsRNA的獲取是進行該研究的前提。目前，通過商業(yè)化試劑盒合成dsRNA的成本太高且操作復雜，原核表達相應基因dsRNA方法的建立，為dsRNA的獲取提供了便利，其僅需少量菌液即可獲取大量目的基因的dsRNA。在利用基因工程菌原核表達dsRNA的方法中，IPTG的使用會使成本增加，探索IPTG最適誘導濃度是減少成本的重要途徑之一。通過對IPTG的濃度的摸索確認最佳的IPTG的使用濃度，同時通過對誘導時間以及誘導溫度的探究確定了最佳的誘導時間與誘導溫度，使通過原核表達獲得dsRNA的效率顯著提高。

通過建立原核表達dsRNA的方法，在快速大量獲取VP5同源基因dsRNA后，可利用其特異性抑制VP5蛋白的表達，為進一步分析該蛋白在病毒復制過程中的作用奠定基礎，同時也為其他病毒蛋白相應基因dsRNA的表達提供借鑒。