信號肽序列對A型流感病毒H1N1 HA蛋白表達的影響

鄭屠園，李婭慧，周繼勇，胡伯里*

(1. 南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；2.浙江大學動物醫學系，農業部動物病毒學重點實驗室，浙江 杭州 310058)

血凝素(hemagglutinin, HA)是A型流感病毒(influenza A virus, IAV)的囊膜蛋白，是引發機體感染的重要蛋白之一，對病毒的致病性以及毒力至關重要。此外，HA在病毒感染過程中也發揮著重要作用：IAV通過HA識別在宿主細胞表面受體，進而吸附在宿主細胞上；還可以介導病毒囊膜與宿主細胞膜的融合，促進病毒入胞，完成感染[1]?，F如今，共發現了18個HA亞型，其中H1～H16在水禽中流行，H17和H18是從蝙蝠中分離出來的[2]。幾乎所有的蛋白質都是在細胞質中合成的，信號肽(signal peptide, SP)是位于新合成蛋白質N端的一段的序列[3]，可以指導蛋白質在胞質的正確轉移。在信號肽的引導下，新生蛋白質向內質網轉移，當蛋白質進入合適的位置后，信號肽序列被切除[4]。然后蛋白質被接著加工轉移，最終到達合適的場所發揮功能。

HA是一個跨膜蛋白，在其N端含有信號肽序列[5-6]。本研究在含Flag標簽真核載體N端和C端分別引入H1N1分離株(A/Puerto Rico/8/34)的 HA 序列，構建帶有HA信號肽序列的SP-HA-Flag載體和缺失信號肽序列的 Flag-HA載體，并利用Western blot和間接免疫熒光檢測H1N1的HA重組蛋白的表達情況，進而分析信號肽的有無對HA表達的影響，期望為HA蛋白功能的深入研究提供一定的基礎信息。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及細胞

大腸桿菌DH5α感受態細胞和293T細胞來自本實驗室保存細胞。A型流感病毒H1N1 (A/Puerto Rico/8/34)株為本實驗室保存材料，通過7～9日齡雞胚擴毒，病毒的毒價為2.0×107TCID50/mL。

1.2 主要試劑

DL5 000 DNA Marker(TaKaRa公司),Flag鼠單抗(Sigma公司),辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗、FITC標記的羊抗鼠IgG熒光二抗(Kirkegaard & Perry Laboratories公司),基因擴增高保真酶Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase試劑盒和T4 DNA連接酶(南京諾威贊生物科技有限公司)，質粒小提試劑盒(天根生物公司)；其他常用試劑為國產分析純。

1.3 HA基因的擴增

根據GenBank中A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)的HA基因(NC_002017.1)的序列設計特異性引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 擴增目的基因的PCR引物

1.4 重組質粒的構建

PCR擴增目的基因后，進行清潔回收?；厥债a物進行雙酶切，酶切體系為：質?；蚰康钠? μg、限制性內切酶各2 μL、10 × Cutsmart buffer 10 μL、ddH2O補至100 μL。37 ℃酶切2 h，回收酶切產物，然后利用T4 DNA 連接酶連接。16 ℃連接過夜，取連接產物轉化DH5α感受態細胞，在含有抗性的LB固體平板上37 ℃過夜培養。挑取單克隆菌落進行菌液PCR鑒定，選取1～3個陽性克隆，送南京通用生物技術有限公司進行測序。將測序比對正確的菌株進行保種以備后續試驗使用。

1.5 Western blot 檢測HA蛋白表達

293T細胞接種至六孔板中，待其貼壁長至密度為50%～60%時，利用Exfect 2000轉染試劑轉染相應質粒，轉染后6～10 h更換培養液為含2% 血清的DMEM，繼續培養至24 h。收集細胞沉淀制樣，進行SDS-PAGE后，轉印至NC膜，于5% 脫脂奶中室溫封閉2 h，用PBST洗膜3次，洗膜完成后根據蛋白Marker大小，剪取所需蛋白大小的膜至稀釋好的Flag鼠單抗中，4 ℃孵育過夜。撈取膜用PBST清洗5次后置于5% 脫脂奶稀釋的HRP-YKS二抗中于37 ℃孵育1 h，再次用PBST清洗5次。利用ECL 化學發光檢測試劑盒進行化學發光顯色，檢測蛋白表達情況。

1.6 間接免疫熒光檢測HA在細胞內的定位

293T細胞接種至共聚焦小皿中，待其貼壁長至密度為50%～60%時，利用Exfect 2000轉染試劑轉染重組質粒，轉染后6～10 h更換培養液為含2%血清的DMEM，繼續培養至24 h。除去上清液，加入1 mL 4% 的多聚甲醛固定液，室溫固定15 min。棄去固定液后，用含5% 脫脂奶的PBS溶液于37 ℃ 封閉30 min。加入5% 脫脂奶稀釋的一抗，于37 ℃ 結合2～4 h。PBS清洗細胞3～5次，再加入5% 脫脂奶稀釋的二抗，于37 ℃ 結合1 h。PBS清洗細胞3～5次，用PBS稀釋DAPI，于室溫孵育細胞10 min。最后觀察蛋白在細胞內的定位。

2 結果

2.1 HA基因擴增及質粒的構建

信號肽引導蛋白進入內質網加工后會被切除，為了避免因信號肽切除而丟失檢測標簽，將標簽蛋白置于HA基因蛋白的C端，成功構建了含有信號肽的SP-HA-Flag載體，菌液PCR鑒定結果如圖1A所示。接著又構建了不含有信號肽序列的Flag-HA載體，菌液PCR鑒定結果如圖1B所示。菌液PCR所得條帶均與陽性對照條帶的分子量大小相符。

M. DNA Marker (DL5000);1～8. PCR產物;-. 陰性對照;+. 陽性對照圖1 重組載體菌液PCR鑒定結果

2.2 信號肽對HA蛋白表達的影響

獲得測序正確且含有信號肽的SP-HA-Flag質粒和不含信號肽的Flag-HA質粒后，將其轉染293T細胞24 h。收取細胞樣品，利用Western blot分別檢測蛋白表達情況，結果如圖2A、圖2B所示，蛋白大小存在明顯差異，并且含有信號肽的HA蛋白表達量低于不含信號肽的HA蛋白表達量。

M．未預染的蛋白分子質量標準；1. HA蛋白圖2 Western blot鑒定重組蛋白表達情況

2.3 信號肽對HA蛋白在細胞內定位的影響

為了研究信號肽對HA蛋白定位的影響，進行了間接免疫熒光試驗，檢測HA在細胞內的定位情況。結果發現，含有信號肽序列的HA蛋白主要集中在胞膜位置(圖3A)，而不含信號肽的HA蛋白主要分布在細胞質中(圖3B)。此外，與圖2結果一致的是含有信號肽的SP-HA-Flag蛋白表達量低于不含信號肽的Flag-HA蛋白表達量。

A．SP-HA-Flag；B．Flag-HA圖3 熒光顯微鏡檢測重組蛋白定位情況

3 討論

流感病毒是造成養禽業重大損失的主要病毒之一，如果防控不當就會造成巨大的經濟損失。HA是流感病毒不可或缺的功能性蛋白，病毒通過HA結合宿主受體進入細胞，參與病毒感染過程。Flag標簽通常不會影響目的蛋白的功能[7]，本文成功構建含有Flag標簽的HA蛋白，這有助于對HA蛋白進行更好的分析。因此，成功構建的重組載體可以用來進行免疫共沉淀及間接免疫熒光試驗，檢測外源性表達的病毒蛋白，節省病毒蛋白抗體的經費支出。信號肽位于新生多肽鏈的N-末端，介導蛋白質向內質網轉移。信號肽在序列和長度上各有不同，通常為含有特征性結構的16至30個氨基酸殘基(N端帶正電荷，具有親水性；中間部分包含數個疏水殘基；C端具有信號肽酶切割位點)[8]。除了可以將蛋白質靶向轉運至內質網膜，信號肽還可以調節蛋白質的分泌效率。盡管已有許多關于信號肽控制蛋白的膜定位的研究，但是還沒有信號肽對于流感病毒HA蛋白的具體表達定位的分析。

本研究中將H1N1的HA蛋白分別引入pCMV-Flag-N及pCMV-Flag-C載體中，其中前者將Flag標簽連接到去除信號肽的HA的氨基端，而后者將Flag標簽連接到未去除信號肽的HA蛋白的羧基端，意在探討信號肽對HA蛋白在細胞中表達的影響。雖然信號肽在引導蛋白到達細胞內合適的位置后會被切除，Western blot結果仍能檢測到部分含有信號肽的蛋白，并且大小明顯大于不含信號肽的蛋白，表明信號肽在指導HA蛋白合成以及定位后，未發生完全剪切。這可能是由于細胞內的剪切酶活力不足以應對快速合成的新蛋白，這種不完全剪切在外源性表達酵母基因工程產物的過程中也會出現[9]。但引起不完全剪切的具體原因，還需要更多的試驗予以探明。熒光顯微鏡檢查結果顯示，HA蛋白的信號肽序列會影響HA蛋白在細胞內的定位，其中，含有信號肽的HA主要定位在胞膜上，而不含信號肽的HA主要定位在胞質中。此外，有數據表明信號肽的有無會影響蛋白的表達及分泌情況[10]。本試驗Western blot 和間接免疫熒光結果都發現，檢測到的含有信號肽的HA蛋白表達量比不含信號肽的HA蛋白表達量少，表明信號肽的存在會減少HA蛋白的表達量，這與蘇艷等[11]的報道是一致的。因此在試驗過程中可以利用信號肽來控制外源性蛋白的表達，但引起蛋白減少的具體原因還有待研究。

有研究顯示，HA信號肽序列部分氨基酸的缺失將會影響HA蛋白糖基化、成熟以及紅細胞凝集的功能[12]，而在本試驗中發現信號肽會影響HA蛋白的表達及定位，因此在抗病毒藥物的研究中可以通過干擾信號肽序列影響HA蛋白的功能, 進而影響子代病毒的產生及傳播。總之，在本文中發現信號肽會影響HA蛋白的表達及定位，這為進一步對HA蛋白進行生物學分析奠定了基礎。