miR-425通過靶向PTPRN2調節(jié)肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲

陳寧 牛垚飛 佑航標 占偉麗 吳賀文

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢[1]，但其發(fā)病機制尚未完全明確。已有研究報道m(xù)iR-425在多種癌細胞中表達水平明顯升高，可促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲[2,3]。本研究旨在探討miR-425對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其作用機制。

資料與方法

一、實驗材料

(一)細胞株 人肝癌細胞系(MHCC-97H、SMMC-7721)和正常肝細胞系HL-7702由復旦大學中山醫(yī)院肝癌研究所提供，人肝癌細胞系HepG2購自中國科學院上海細胞庫。所有細胞株生長在含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 mg/mL)的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(二)主要試劑 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司；轉染試劑LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM購自大連Takara公司；miR-425 mimic、miR-425 inhibitor、陰性對照(NC)、干擾PTPRN2表達的質粒(si-PTPRN2)和對照質粒(si-NC)由上海吉瑪生物公司合成；Transwell小室和基質膠購自美國BD公司；熒光素酶檢測試劑盒來源于美國Promega公司；實驗所需的一抗和二抗購自美國Abcam公司。

二、實驗方法

(一)實時熒光定量PCR檢測miR-425 利用RNA提取試劑盒提取細胞中總RNA，然后反轉錄為cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒按照說明書進行PCR。miR-425和內參U6的引物由上海吉瑪生物公司設計并合成。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、70 ℃延伸10 s共40個循環(huán)，獲得Ct值，利用公式2-ΔΔCt計算相對表達量。

(二)MTT實驗 將轉染成功的對數(shù)期細胞使用胰酶消化后，制成單細胞懸浮液并以每孔1000個細胞數(shù)接種到96孔板中，置于37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24、48和72 h，每孔加入20 μL MTT并充分混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后緩慢吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，待結晶物質充分溶解后，以空白孔調零，在Bioteck DR-3506全自動酶標儀上測定波長為490 nm的吸光度(A)值。

(三)Transwell遷移和侵襲實驗 首先將轉染后第2天的肝癌細胞用無血清的DMEM培養(yǎng)基制備成1×106個/ml的細胞懸液，然后在24孔板中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基1 mL，將Transwell小室放在孔上，吸取200 μL細胞懸液分別加入小室(遷移實驗)和鋪有基質膠的小室(侵襲實驗)中。兩種實驗的每組均設置3個復孔，置于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用棉簽輕輕地除去小室內側的細胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結晶紫溶液對小室底部細胞進行染色，于倒置顯微鏡下觀察、拍照并計數(shù)。

(四)雙熒光素酶實驗 首先將肝癌細胞HepG2接種于24孔板中，分3組：野生型質粒組、突變型質粒組和對照組，分別共轉染miR-425 mimic和野生型質粒pGL3-PTPRN2 3′UTR Wt，共轉染miR-425 mimic和突變型質粒pGL3-PTPRN2 3′UTR Mut，共轉染miR-425 mimic和對照熒光素酶質粒。轉染48 h后制備裂解物，利用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)(Applied Biosystems)進行熒光活性檢測，以海腎熒光素光吸收值作為內參，獨立重復實驗3次。

(五)蛋白質印跡實驗 利用磷酸鹽緩沖液清洗待測肝癌細胞3次，加入細胞裂解液(含有蛋白酶抑制劑)提取細胞中的總蛋白，100℃ 5 min進行變性。用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入PTPRN2一抗(1∶1 000)、內參GAPDH一抗(1∶2 000)，4℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST充分清洗后加入發(fā)光液，最后利用凝膠成像儀進行曝光、拍照并測定灰度值計算目的蛋白的表達水平。

三、統(tǒng)計學分析

利用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、miR-425在肝癌細胞系中的表達情況

miR-425在正常肝細胞系HL-7702及不同肝癌細胞系HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H中的表達量分別為：1.00±0.03、2.01±0.13、3.97±0.24、9.14±0.26。與正常肝細胞相比，miR-425在肝癌細胞中的表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

二、封閉miR-425抑制肝癌細胞的增殖

與轉染陰性質粒的MHCC-97H細胞相比，miR-425的表達水平在轉染miR-425 inhibitor組細胞中顯著下降(1.05±0.08比0.28±0.03)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果表明，miR-425 inhibitor可明顯降低MHCC-97H細胞中miR-425的表達。隨后利用MTT實驗檢測miR-425對肝癌細胞增殖情況的影響。如圖1所示，與NC組相比，miR-425 inhibitor組細胞的生長速度明顯減慢；培養(yǎng)72 h后MHCC-97H細胞的增殖能力顯著低于對照組(P<0.05)。由此可見，封閉miR-425的表達可明顯抑制肝癌細胞的增殖。

圖1 miR-425對肝癌細胞增殖的影響

三、封閉miR-425抑制肝癌細胞的遷移和侵襲

利用Transwell遷移和侵襲實驗檢測miR-425對肝癌細胞MHCC-97H遷移和侵襲能力的影響。如圖2A所示，miR-425 inhibitor組遷移細胞數(shù)比NC組顯著減少(45±5比118±10，P<0.01)。如圖2B所示，miR-425 inhibitor組侵襲細胞數(shù)明顯少于NC組(32±5比94±8，P<0.01)。由此可見，封閉miR-425可明顯抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力。

圖2 miR-425對肝癌細胞遷移和侵襲的影響

四、雙熒光素酶實驗驗證miR-425與PTPRN2的靶向關系

生物信息學預測miR-425種子序列可與PTPRN2 3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)配對結合，然后利用雙熒光素酶實驗驗證二者之間的靶向關系。與對照組相比，共轉染miR-425 mimic和PTPRN2 3′UTR野生型質粒細胞的熒光素酶活性明顯降低(0.99±0.09比0.40±0.03，P<0.05)；而共轉染miR-425 mimic和PTPRN2 3′UTR突變型質粒細胞的熒光素酶活性無明顯變化(1.00±0.05比0.93±0.07，P>0.05)。如圖3所示，與對照組相比，miR-425 mimic組MHCC-97H細胞中PTPRN2蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。由此可見，miR-425可直接靶向結合PTPRN2并下調其蛋白表達水平。

圖3 miR-425對PTPRN2蛋白表達水平的影響

五、miR-425通過靶向PTPRN2影響肝癌細胞的增殖能力

封閉miR-425的表達后肝癌細胞MHCC-97H的增殖水平明顯受抑制，隨后在miR-425 inhibitor 組細胞中沉默PTPRN2蛋白表達，利用MTT實驗檢測細胞的增殖水平是否可被逆轉。如圖4所示，miR-425 inhibitor+si-NC組MHCC-97H細胞的增殖能力明顯低于NC+si-NC組(P<0.05)；與miR-425 inhibitor+si-NC組相比，miR-425 inhibitor+si-PTPRN2組MHCC-97H細胞的增殖能力明顯升高(P<0.01)。結果表明，miR-425通過靶向下調PTPRN2的表達水平促進肝癌細胞的增殖。

圖4 miR-425通過靶向PTPRN2影響肝癌細胞的增殖

六、miR-425通過靶向PTPRN2影響肝癌細胞的遷移和侵襲能力

封閉miR-425的表達后肝癌細胞MHCC-97H的遷移和侵襲能力明顯受抑制，隨后在miR-425 inhibitor 組細胞中沉默PTPRN2蛋白表達，利用Transwell遷移和侵襲實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力是否可被逆轉。如表1所示，miR-425 inhibitor+si-NC組遷移和侵襲肝癌細胞數(shù)均明顯低于NC+si-NC組(均P<0.01)，與圖2結果一致；與miR-425 inhibitor+si-NC組相比，miR-425 inhibitor+si-PTPRN2組遷移和侵襲肝癌細胞數(shù)均明顯增高(均P<0.01)。結果表明，miR-425通過靶向下調PTPRN2的表達水平促進肝癌細胞的遷移和侵襲。

表1 miR-425通過靶向PTPRN2影響肝癌細胞的遷移和侵襲(±s，n=6)

討 論

越來越多的研究表明，肝癌組織和細胞系中多種miRNA表達失調，通過調控某些癌基因或抑癌基因的表達水平，參與肝癌的發(fā)生發(fā)展進程[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)miR-122a在肝癌組織和細胞系中均表達下調，通過靶向抑制細胞周期蛋白cyclinG1的表達可使肝癌細胞阻滯于S期[6]。Meng等[7]研究證實，miR-21在肝癌組織中明顯高表達，可通過靶向下調抑癌基因PTEN的蛋白表達促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程。Lin等[8]研究報道，在肝癌細胞系中miR-122的表達顯著下調，miR-122可抑制凋亡相關Bcl-2家族成員Bcl-w的蛋白表達，間接激活caspase-3從而促進肝癌細胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-425在肝癌細胞系中的表達水平顯著高于正常肝細胞；抑制miR-425 表達后，肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力均明顯受到抑制。隨后，對于miR-425作用的靶基因及其發(fā)揮介導肝癌細胞生長、遷移和侵襲功能進行進一步的研究。首先利用生物信息學軟件TargetScan和miRanda對miR-425作用的可能靶基因進行預測分析，結合基因的已知功能，最終篩選出受體型蛋白酪氨酸磷酸酶N2(receptor-type tyrosine-protein phosphatase N2，PTPRN2)為其候選靶基因并作為進一步研究的對象。

蛋白質酪氨酸磷酸酶參與細胞的信號轉導，調節(jié)細胞生長、分化、代謝、基因轉錄和免疫應答，在調控腫瘤生長過程中發(fā)揮重要作用[9]。已有研究表明， PTPRN2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的成員，在肺癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質瘤等多種腫瘤呈現(xiàn)異常表達[10]，并與細胞凋亡存在密切聯(lián)系[11]。近年來有研究表明，PTPRN2可抑制腫瘤細胞的增殖和活力，發(fā)揮抑癌基因作用[12]。本研究表明，在肝癌細胞MHCC-97H中，miR-425可直接靶向作用于PTPRN2并負調控其蛋白表達。在肝癌細胞MHCC-97H中，利用小干擾RNA技術沉默PTPRN2蛋白表達后再次進行細胞學功能實驗，結果發(fā)現(xiàn)抑制PTPRN2蛋白表達后，可逆轉封閉miR-425表達后的作用，使肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力均明顯升高。