利用肝前體細胞治療肝纖維化

李為雨 楊愛婷 尤紅

肝纖維化是肝損傷后細胞外基質沉積或瘢痕形成的動態過程，可持續進展為肝硬化，甚至肝癌等終末期肝臟疾病。美國食品和藥物管理局(FDA)目前尚無批準用于治療肝纖維化的藥物，現階段肝移植是少數發生肝硬化相關并發癥(例如肝癌和肝衰竭)的患者唯一的治療手段。但由于器官短缺的客觀問題存在，促進成人肝臟修復和再生的特異細胞和分子機制的研究迫在眉睫。同時，對于機制的進一步研究有助于確定臨床治療靶點。

成年人急性肝損傷后，肝細胞的再生往往通過剩余健康肝細胞和膽管細胞的增殖和擴增實現，而肝前體細胞的參與則很少。相比之下，慢性肝損傷的修復涉及肝前體細胞的增殖和具有一定干細胞樣特性的細胞向肝細胞和膽管細胞分化，從而支持肝功能的恢復[1-2]。目前，雖已發現多種前體細胞的標記，但沒有一個完全特異。最近的研究表明，肝臟前體細胞實際上是一個包含多種細胞類型的異質性群體，從原始的前體細胞到更為分化的細胞(如肝細胞樣)均包含在內。事實上，在成年小鼠中，前體細胞包括膽汁樣細胞(在嚙齒類動物中也被稱為“橢圓形細胞”)、中央靜脈周圍的前體細胞、去分化的肝細胞或膽管細胞、以及顯示出免疫調節特性的多潛能間充質干細胞(MSC)[2-3]。 人類身上亦可出現類似的異質性現象。EpCAM+/NCAM+雙功能前體細胞存在于胎兒時期的肝板中，隨后保留在成人肝臟的膽小管中。這類前體細胞共表達與肝臟和膽管相關的基因(例如SOX9、HNF1B、K19、CD24、CD133、K7和OPN)[3]。在損傷過程中，成熟的肝細胞和膽管細胞也可 “轉分化”，從而產生混合雙能前體細胞，因此導致不同類型的肝細胞之間的“標志物”表達有很大的重疊。由于特異性抗體的缺乏以及免疫標記有限的解析率，因此成人肝細胞的身份和來源往往出現明顯矛盾的報道。現如今，單細胞轉錄組學的出現使我們有望能更準確地定義這些前體細胞群體。如肝星狀細胞(HSCs)一直被認為是肝纖維化過程中表達出肌成纖維細胞(MFs)的主要來源， 但最近在一種嚙齒動物肝纖維化模型中進行的單細胞RNA測序研究表明，MFs實際上是一個異質性群體，即HSC共同表達MSC的標志，HSC衍生的MFs才是有助于肝臟再生的多潛能前體細胞[4]。這些新方法也可以幫助闡明內皮細胞和骨髓來源的前體細胞在纖維化和修復中的作用。

Dai的團隊證明(人工誘導的)擴大的肝前體細胞群可以改善兩種小鼠模型的肝纖維化，增進了我們對“前體細胞相關修復”的理解[5]。具體來說，他們發現HSC衍生的生長分化因子11(GDF11)直接增加了富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體5(Lgr5)及前體細胞的數量，而這些前體細胞亦表達其干細胞標記，如CD133和EpCAM，以及膽管細胞標志物Keratin19和肝細胞標志物肝細胞核因子(HNF)4A[3]。他們進一步指出，在體外實驗中向MFS中添加Lgr5陽性前體細胞顯著抑制纖維形成。同時，將Lgr5陽性的前體細胞注射到CCl4和DDC處理的小鼠中時，小鼠體內纖維化減輕。而重組GDF11治療或GDF11過表達的Lgr5陽性前體細胞進一步抑制了纖維化形成。相反，在小鼠中敲除Lgr5陽性前體細胞群肝纖維化進一步進展(圖1)。

雖然上述結論令人信服，但也依舊留下了一些問題，即Lgr5陽性前體細胞通過什么潛在機制減少肝纖維化？此外，在慢性肝損傷過程中觀察到的膽管反應(在小鼠中也稱為肝前體細胞反應)是可預測性的，并與肝纖維化相關。Coombes等[6]先前報道SOX9+OPN+K19+肝前體細胞可以分泌OPN，進一步激活HSC分化成MF。Machado和Diehl也在一系列報道中證明，肝前體細胞和HSC-MF都可以分泌Hedgehog配體來自我調節和放大纖維化結局[7]。我們如何才能調和肝臟結局中的這些明顯差異？或許是因為這些研究中使用的前體細胞群體彼此不同，Dai和他的同事們揭示了“其他兼性干細胞”可能正在發揮抗纖維化作用。

決定肝臟預后的另一個因素是微環境，即在損傷和修復過程中存在或不存在其他細胞和分子信號，單個前體細胞亞群可能受到不同的調節。轉化生長因子β(TGF-β)家族蛋白在創傷愈合和發育過程中起著重要作用，GDF11是其中之一。GDF11此前已被報道可調節發育中的視網膜中的前體細胞生長，證實過表達GDF11可以防止肝纖維化[5]。然而，TGF-β家族的成員在功能上經常表現出明顯兩極分化。例如，骨形成蛋白(BMP)-9在肝損傷的早期下調，在肝損傷的后期，在組織的再分化過程中上調，在纖維化模型中抑制BMP-9可以抑制疾病的進展[8]。另一項研究進一步表明，BMP-9通過負調控卵圓細胞，部分誘導肝纖維化[9]。相反，使用另一種小鼠品系(129/Ola)的研究表明，BMP-9抑制了肝竇內皮細胞的毛細血管化[10]。除了TGF-β之外，OPN也具有類似的特點。例如，OPN基因敲除的小鼠在CCl4模型中相較野生型小鼠出現了更多的纖維化，但在飲食誘導的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中纖維化程度較輕，并且OPN的生物學功能在疾病的早期和晚期也可能有所不同[6-7]。因此，可以想象，在HSC-MF中過表達GDF11(其效應壓倒了OPN、Hedgehog、BMPs和其他促纖維化配體)會導致趨向恢復的特定前體細胞群體的擴張。由于肝前體細胞分泌一系列趨化因子(包括CXCL16、MCP1、CCL17和CCL20)，招募免疫細胞來協調修復相關的炎癥反應，GDF11(過)富集的微環境也可能刺激趨化因子的前體細胞分泌趨化因子，這些趨化因子優先招募和保留纖維降解免疫亞群(例如Ly6C低巨噬細胞)。

(A)富含促纖維化因子(或低GDF11水平)的肝臟微環境可激活靜止的星狀細胞(HSC)向產生膠原的成纖維細胞轉變，并通過招募促纖維化免疫亞群直接或間接地刺激肝臟前體細胞增強成纖維;(B)當GDF11水平較高時，肝臟微環境的纖維化程度較低(或更新程度較高)。高水平的肝星狀細胞來源的GDF11促進抑制纖維形成的肝前體細胞的擴展，也可能增加疤痕消除免疫亞群的招募。

綜上所述，利用肝前體細胞治療肝纖維化是有希望的方案，但仍有很多工作要做。除了更精確地識別各種肝臟前體細胞亞群，我們還需要更好地理解細胞和分子信號如何在體內平衡和疾病條件下整合，以調節修復和再生。這一點對人類尤其重要，因為慢性肝病的發病過程通常是長期的，而肝臟前體細胞在人類慢性肝病中的作用尚不清楚。