魚腥草生物堿對5種肺癌細胞的抑制作用

付騰飛，薛興陽，孟 江

(1.廣州市第一人民醫院南沙醫院，廣東 廣州 510000；2.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院，廣東 廣州 510095；3.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜HouttuyniacordataThumb.的新鮮全草或干燥地上部分，具有清熱解毒、利尿通淋、消腫排膿的功效，魚腥草歸肺經，善治各種肺癰，常用于肺癰吐膿、痰熱咳嗽、熱痢熱淋以及瘡瘍腫毒的治療，也是藥食兩用的中藥植物資源之一[1]。研究發現，從天然植物中提取的生物堿類化學成分具有良好的抗腫瘤功效,其療效高、耐受性好、毒副作用小，在抗腫瘤治療領域處于優勢地位[2]。魚腥草中已報道的生物堿類化合物有70多種，藥理活性研究顯示其具有良好的抗炎、抗病毒、抗血小板聚集、肝保護等方面作用，具有廣闊的應用前景[3]。祖國醫學將魚腥草列作“肺癰之要藥”，其傳統湯藥和現代注射液劑型應用于肺癌的治療顯示出良好的臨床療效[4-6]。本研究選取臨床常見的5種肺癌細胞(95D、A549、SPC-A-1、H1975、H460)，研究魚腥草生物堿類組分對肺癌腫瘤細胞的作用，以期為魚腥草生物堿類組分應用于肺癌治療提供實驗研究依據。

1 研究材料

魚腥草藥材從廣州清平藥材市場購得，經廣東藥科大學劉基柱教授鑒定為三白草科蕺菜HouttuyniacordataThunb。鹽酸小檗堿為實驗室自制(純度>98%)。HPD-100型大孔吸附樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司)，人肺癌細胞株95D、A549、SPC-A-1、H1975、H460保存于廣州醫科大學附屬腫瘤醫院腫瘤研究所，RPMI1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco公司，MTS試劑盒購自Promega公司(CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 貨號G3580)，細胞凋亡Hoechst 33258染色試劑盒購自碧云天公司(產品編號C0003)。

2 研究方法

2.1 魚腥草生物堿類成分的提取和純化

干魚腥草藥材4 kg，碎成粗粉，用20倍95%乙醇回流提取，每次2 h，提取2次。回收乙醇，用0.5%HCl溶液調pH=2～3，過濾，濾液用1%NaOH溶液調pH=5～7，靜置除去沉淀，繼續調pH=9～11，減壓濃縮得魚腥草生物堿粗浸膏。制備20 mg/mL的魚腥草生物堿上樣液，調pH=3.0，取樣品液40 mL，以0.5 mL/min的流速通過預處理好的d101-100樹脂。靜置吸附2 h，用60 mL蒸餾水沖洗，再用10%～90%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮得魚腥草生物堿浸膏11.375 2 g，得率0.284 4%[7-9]。

2.2 提取物中生物堿的含量測定及工作液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對照品12.35 mg，置于25 mL容量瓶內，加95%乙醇15 mL，定容搖勻得0.494 mg/mL對照品溶液。分別移取對照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于25 mL容量瓶中，定容至25 mL。用乙醇作空白對照，265 nm處測吸光度，以濃度X為橫坐標，吸光度Y為縱坐標，得回歸方程：Y=52.826X+0.057 7，R2=0.999 7。用此方法得浸膏中生物堿含量為65.43%。加入磷酸鹽緩沖液配成1 mg/mL的工作液，0.22 μm濾膜過濾，4 ℃冰箱保存。

2.3 MTS實驗

復蘇置于液氮中的5種肺癌細胞株，隔天換液，細胞生長至80%左右傳代，置于37 ℃和5%CO2的細胞孵育箱中培養。鏡下觀察，分別取對數生長期的肺癌細胞，胰酶消化后，用培養基調整細胞濃度為5×104個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL細胞懸液，置于細胞孵育箱中培養。用磷酸鹽緩沖液調節魚腥草生物堿的濃度分別為0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL,每孔100 μL藥液，每個濃度5個副孔，48 h后棄上清，磷酸鹽緩沖液洗滌后，加入100 μL培養基，避光加入MTS試劑，每孔10 μL，4 h后用酶標儀檢測490 nm波長處的光密度A490，重復3次，計算A490平均值。計算相對抑制率，公式如下，再通過IC50計算軟件算出5種細胞的IC50。

相對抑制率(%)=(1-試驗組A490/對照組A490)×100%

2.4 形態學觀察

根據IC50設置4個濃度(0、1/2IC50、IC50、2IC50)，分別處理5種肺癌細胞，于細胞孵育箱中培養48 h。于倒置顯微鏡下觀察加藥前后肺癌細胞形態變化。

2.5 Hoechst 33258染色

取潔凈蓋玻片，70%乙醇中浸泡5 min后晾干，用磷酸鹽緩沖液洗滌1次，接種細胞于六孔板內培養。細胞密度約70%時，取濃度為IC50的魚腥草生物堿工作液處理細胞，培養48 h。將培養液吸出，加入固定液0.5 mL，固定10 min，吸出固定液，用磷酸鹽緩沖液洗滌。加入Hoechst 33258染色液0.5 mL，5 min后吸去染色液，加磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，用抗熒光淬滅封片液封片，于倒置顯微鏡下觀察。

2.6 統計學分析

使用SPSS 22.0對實驗結果進行分析，實驗數據用均數加減標準差(mean±SD)表示，兩兩比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 研究結果

3.1 魚腥草生物堿對5種肺癌細胞體外增殖的影響

抑制曲線如圖1(SigmaPlot 14繪制)，由圖1可以看出，魚腥草生物堿對這5種肺癌細胞的體外增殖具有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性，不同肺癌細胞對魚腥草生物堿的耐受程度不同，其中人高轉移肺癌細胞95D對該藥最為敏感，人大細胞肺癌細胞H460對該藥耐受程度最高，相差約4倍。(95D、A549、SPC-A-1、H1975、H460的IC50分別為29.51 μg/mL、72.04 μg/mL、67.94 μg/mL、54.00 μg/mL、130.17 μg/mL)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 細胞形態學觀察

如圖2所示，正常生長狀態下的腫瘤細胞，其形態呈現一定規則，鏡下視野光亮明晰，細胞貼壁牢固，邊緣充分伸展，少量空泡，使用魚腥草生物堿處理之后，較低濃度下，可見細胞開始萎縮，細胞體積開始變小，細胞形態開始呈現不規則形狀，偽足部分消失。95D細胞是人高轉移肺癌細胞，遷移性較強，由于其自身偽足發達，加藥處理之后其萎縮變化最顯著。隨著魚腥草生物堿的濃度逐步增大，細胞進一步萎縮變小，不貼壁的細胞增多，部分細胞脫落死亡，細胞數量減少，同時可以觀察到細胞折光性開始降低，固縮黑斑也增多，這些形態變化證實了魚腥草生物堿可以抑制肺癌細胞的體外增殖，且呈濃度依賴性。

圖2 魚腥草生物堿處理5種肺癌細胞48 h后形態變化(100×，μg/mL)

3.3 Hoechst 33258染色觀察魚腥草生物堿對肺癌細胞細胞核的影響

Hoechst 33258是一種DNA熒光染料,具有膜透性，與DNA雙鏈中的小溝結合后，在熒光顯微鏡350 nm紫外光激發下，可以檢測到藍色的細胞核，正常腫瘤細胞經該染料染色后，細胞核呈淺藍色，圓形或類圓形，可以觀察到藍色顆粒，發生凋亡的腫瘤細胞，其胞膜的通透性增加，程度介于正常細胞核壞死細胞之間，使得染料可以進入細胞，使胞核著染。Hoechst 33258可以使核內凝聚的染色質呈現高亮度的藍色熒光[10]。從圖3染色結果可以看出，正常情況下的腫瘤細胞的細胞核呈藍色，具有一定規則形狀，分別經魚腥草生物堿以IC50濃度處理48 h后，細胞核碎裂，固縮，致密濃染，呈藍白色熒光，不同種類的肺癌腫瘤細胞其碎片數、濃染程度不同，其中H1975表現得尤為明顯。該染色提示魚腥草生物堿有可能通過誘導肺癌細胞發生凋亡來抑制其增殖。

圖3 魚腥草生物堿處理5種肺癌細胞48 h后Hoechst染色圖(μg/mL)

4 討論

肺癌是一種對人民群眾生命健康構成最大威脅的疾病之一，其發病率和死亡率呈逐年上升趨勢[11]。中醫藥在治療肺癌方面發揮著獨特作用，尤其是減輕放化療毒副作用、預防復發轉移、提高生活質量以及生存期等方面有顯著優勢[12]，與表皮生長因子絡氨酸激酶抑制劑聯用可逆轉非小細胞肺癌獲得性耐藥[13]。魚腥草含有揮發油、黃酮、生物堿、多糖以及有機酸等生物活性物質，常應用于抗菌、抗炎以及抑制腫瘤細胞的治療，研究表明其提取物對多種腫瘤細胞有抑制作用[14-16]。本研究對魚腥草中生物堿類成分的抗肺癌作用進行了初步探究，選取了臨床常見的5種肺癌細胞，證實了其對肺癌細胞的廣泛抑制作用，并對抑制的量效關系進行了研究，結果表明，魚腥草生物堿類成分對人巨細胞肺癌細胞95D的抑制作用最為明顯，95D細胞為為人高轉移肺癌細胞，提示該類成分有可能通過抑制肺癌細胞轉移發揮抑制作用。

細胞凋亡是細胞的一種生理性死亡，屬基因控制的主動死亡過程[17],當細胞凋亡過程受到影響，細胞群增殖和凋亡平衡被打破，異常細胞增殖速度快于凋亡速度，腫瘤便會形成。細胞凋亡可以反向調控腫瘤的進展過程，通過誘導腫瘤細胞啟動凋亡被認為是富有前景的治療手段[18]。細胞凋亡過程中，核染色質斷裂成不同大小的片段，與線粒體等細胞器聚集，被細胞膜包圍以后，有許多芽狀或者泡狀的突起，逐漸分開后，形成凋亡小體[19]。Hoechst 33258染色結果表明加藥處理過的腫瘤細胞均出現了凋亡小體，配合加藥后腫瘤細胞形態變化，證實魚腥草生物堿類成分有可能通過誘導肺癌腫瘤細胞凋亡發揮抑制作用，其具體機制有待進一步研究。