MTDH基因和ATG7基因在結直腸癌中的表達及臨床意義

張繼業，趙麗寧，王勝良

三門峽市中心醫院普外科，河南 三門峽 472000

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是高發的消 化系統惡性腫瘤，便血是其最常見的臨床表現。近年來CRC的發病率及病死率呈現逐年遞增趨勢，腫瘤轉移和腫瘤復發是CRC患者死亡的常見原因[1]。異黏蛋白（metadherin，MTDH）基因定位于8號染色體長臂22.5[2-3]。研究顯示，MTDH基因在肝細胞癌、胃癌、CRC和乳腺癌等惡性腫瘤中異常表達，腫瘤細胞的增殖、侵襲和耐藥過程中扮演重要角色[4-7]。自噬相關基因7（autophagy related7，ATG7）編碼的蛋白質屬于E1樣泛素化連接酶可增強細胞自噬活性，當ATG7基因表達上調激活并誘導的自噬活性增強與CRC發生、發展有關[8-9]。但CRC中關于MTDH基因和ATG7基因表達研究較少，本研究探討MTDH基因和ATG7基因在CRC中的表達及臨床意義，以期為臨床治療提供依據，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 標本來源

選取三門峽市中心醫院2013年7月至2018年7月的經病理科確診后行手術切除的66例CRC患者，納入的患者術前均未接受放、化療等；排除非首次確診的患者。本研究共納入66例CRC患者，男性35例，女性31例，年齡43～84歲，平均（62.42±9.95）歲，TNM分期參照美國癌癥聯合委員會第八版結直腸癌分期標準[10]。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有研究對象及家屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書。收集CRC患者的CRC組織和對應的癌旁正常組織（距離腫瘤病灶邊緣2 cm及以上），切除組織后立即放入液氮中儲存備用。

1.2 實驗方法

采用美國Invitrogen公司的Trizol試劑盒按照說明書從組織中提取總RNA：液氮研磨-樣本裂解-抽提-漂洗-洗脫。采用NanoDrop 2000檢測提取的RNA濃度，隨后采用日本Takara公司的反轉錄試劑盒進行逆轉錄獲得cDNA。采用實時熒光定量核酸擴增檢測系統（real-time quantitative PCR detecting system，q-PCR）聯合SYBR Green I法在羅氏480儀器上檢測CRC組織和癌旁組織中MTDHmRNA、ATG7mRNA的相對表達水平，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA表達水平為內參。MTDH上游引物：5'-CAGAGTTCCACCTGCTGACA-3'，下游引物：5'-TTCTCAGGCAGGAGTTTGGT-3'；ATG7上游引物：5'-AGCTTGGCTGCTACTTCTGC-3'，下游引物 ：5'-GTCCGGTCTCTGGTTGAATC-3'；GAPDH上游引物：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3'，下游引物 ：5'-GGAAGATGGTGATGGGATTT-3'。兩步法q-PCR反應步驟：預變性95 ℃ 30 s；擴增95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、40個循環；溶解72℃延伸20 s/35個循環；溶解95℃5 s、60℃1 min；降溫50℃30 s。實驗結果重復3次，取平均值。

1.3 觀察指標

比較CRC組織及癌旁組織中的MTDHmRNA、ATG7mRNA的相對表達水平，比較不同臨床特征的CRC患者CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA的相對表達量；CRC組織/癌旁組織中，MTDHmRNA和ATG7mRNA診斷結直腸癌的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析和MTDHmRNA 與ATG7mRNA的相關性分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用ROC曲線評價MTDHmRNA與ATG7mRNA對CRC診斷價值；CRC患者相關性分析采用Pearson檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC 組織與癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA的相對表達量的比較

CRC組織中MTDHmRNA的相對表達量為（4.57±1.31），顯著高于癌旁組織的（2.36±0.98）；ATG7mRNA的相對表達量為（5.16±0.83），顯著高于癌旁組織的（3.33±1.11），差異均有統計學意義（t=11.99、10.64，P＜0.01）。66例CRC患者中，63例患者CRC組織/癌旁組織的MTDHmRNA比值＞1；61例患者CRC組織/癌旁組織的ATG7mRNA比值＞1。

2.2 MTDHmRNA和ATG7mRNA表達與CRC患者臨床特征的關系

不同性別、年齡CRC患者CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA的表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和有肝轉移CRC患者CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA的相對表達量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期和無肝轉移的CRC患者，差異均有統計學意義（t=4.531、3.606、5.833、2.713，P＜0.01）。低分化程度的CRC患者中CRC組織/癌旁組織中的MTDHmRNA和ATG7mRNA相對表達量最高，差異有統計學意義（F=15.433、17.463，P＜0.01）。（表1）

2.3 CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA診斷CRC 患者的價值

CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA診斷CRC患者的AUC為0.934（95% CI：0.890～0.978）、0.900（95% CI：0.839～0.961），分別取MTDHmRNA=3.18和ATG7mRNA=4.01為截斷值，其靈敏度分別為90.91%和89.39%，特異度分別為86.37%和84.35%。（圖1）

表1 不同臨床特征的CRC患者CRC組織/癌旁組織中MTDH mRNA和ATG7 mRNA表達情況（n=66）

圖1 CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA診斷CRC的ROC曲線

2.4 CRC組織/癌旁組織中的MTDHmRNA與ATG7mRNA 的相關性

CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA比值與ATG7mRNA比值呈正相關（r=0.372，P=0.002）。

3 討論

CRC是常見的消化系統惡性腫瘤，發病率癌消化系統惡性腫瘤中居第四位，僅次于胃癌、食管癌和原發性肝癌[11]。本病多見于40～70歲人群，血便是CRC患者的最常見癥狀，CRC發病原因暫不清楚，可能與腸息肉、潰瘍性結腸炎、血吸蟲、高脂飲食、吸煙和遺傳等多種因素有關，目前主要采取手術和放射兩種方法。目前，中國CRC的發病率及病死率表現為明顯升高趨勢、地域上東部高西部低、城市高于農村等[12-13]。

腫瘤形成的一個重要原因是癌基因的激活和轉錄蛋白的表達，如MTDH基因激活誘導CRC增殖。早期MTDH基因編碼的蛋白被認為是介導腫瘤細胞與肺血管內皮細胞進行黏附的單向跨膜蛋白。然而隨后的研究表明MTDH基因編碼的蛋白主要定位于細胞質或細胞核而非細胞膜，表明其并非單向跨膜蛋白[14]。近年來，研究顯示MTDH基因在多種惡性腫瘤中通過調節信號通路促進腫瘤生長、血管新生、侵襲轉移和治療藥物抵抗等作用[3,15]。MTDH的mRNA相對表達量在子宮內膜的正常組織中高于不典型增生子宮內膜和子宮內膜癌，且其相對表達量與腫瘤大小、淋巴結轉移、脈管浸潤、TNM分期、組織學分化程度和預后不良呈明顯的正相關性[16]。本研究結果顯示，CRC患者的CRC組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA的相對表達量，均顯著高于癌旁組織（P＜0.01）。TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和有肝轉移的CRC患者中，CRC組織/癌旁組織中的MTDHmRNA和ATG7mRNA的相對表達量，均顯著高于Ⅰ～Ⅱ期和無肝轉移的CRC患者（P＜0.01）。低分化程度的CRC患者中，CRC組織/癌旁組織中的MTDHmRNA和ATG7mRNA相對表達量最高（P＜0.01）。CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA診斷結直腸癌的ROC曲線下面積分別為0.934和0.900，其靈敏度分別為90.91%和89.39，特異度分別為86.37%和84.35%，結果表明MTDH基因可能成為CRC診斷的新腫瘤標志物，在CRC的分子靶向治療中具有重要意義。

自噬是真核細胞通過溶酶體途徑降解細胞內受損的細胞器等大分子物質的生命過程，完成細胞代謝過程，可以促進細胞的生長、增殖，也能對不良刺激進行應答實現自我保護，同時也與腫瘤的發生發展密切相關，具有多重作用[17]。ATG7基因編碼的蛋白是參與自噬過程的重要蛋白能結合并調控p53蛋白來調控細胞周期進展[18]。研究表明，ATG7基因與CRC、肺癌、肝癌等多種腫瘤異常增殖相關。當ATG7基因過表達時CRC的增殖能力明顯增強[8]；小鼠模型中，ATG7基因缺失顯著降低肺癌癌變的成瘤能力；敲除ATG7基因能夠抑制腸上皮腫瘤的發生發展、促進機體的抗腫瘤反應[19]。ATG7基因介導的細胞自噬還能夠促進腫瘤細胞耐藥性的產生，例如肝癌細胞中ATG7基因通過促進自噬發生，增強索拉非等化療藥物的耐藥性[20-21]。MTDHmRNA比值與ATG7mRNA比值呈正相關，表明在CRC中MTDH的過度活化促進了自噬的發生，MTDH有望成為CRC診斷和治療的新的靶標分子，但具體的機制還需要進一步研究。

綜上所述，MTDHmRNA和ATG7mRNA在CRC中表達增高，此次研究為MTDH和ATG7在CRC中的意義提供了新的見解，提示可以成為發現CRC的較好指標。