宮頸鱗狀細胞癌對DDP和DDP+5-FU 的體外藥敏檢測及與耐藥蛋白表達的關系研究△

蘇豐麗，孔為民#，劉志茹，宋丹，卞麗紅

1首都醫(yī)科大學附屬北京婦產醫(yī)院婦瘤科，北京 100006

2北京美中宜和婦兒醫(yī)院婦科，北京 100015

3解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心婦科，北京 100071

子宮頸癌是全球女性第四大常見惡性腫瘤，約90%發(fā)生在中低收入國家[1]。2019年美國宮頸癌新增病例和死亡人數(shù)已呈下降趨勢[2]，而在不發(fā)達國家宮頸癌的5年生存率仍不足50%[3]，嚴重威脅著女性健康，因此宮頸癌的治療仍是全球醫(yī)療研究的熱點。20世紀90年代，在發(fā)表了五項大型臨床試驗后，美國國家癌癥研究所批準以順鉑為基礎的同步放化療成為中晚期宮頸癌的標準治療方法。目前臨床上同步放化療的常用化療方案為順鉑（cisplatin，DDP）和DDP+5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU），這也是美國國家綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南所推薦的方案，但哪種方案療效好還有爭議，因此本研究采用三磷酸腺苷生物熒光法（triphosadenine bioluminescence tumor chemosensitivity assay，ATP-TCA）對這兩種常用化療方案進行藥敏檢測，比較其體外有效率。同時檢測其耐藥蛋白P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、谷胱甘肽 S-轉移酶-π（glutathione S-transferase-π，GST-π）、DNA 拓撲異構酶Ⅱ（topoisomerasⅡ，TopoⅡ）、胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）的表達，分析化療藥物敏感性與耐藥蛋白表達的關系，為臨床預測化療藥物耐藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1月至2019年1月首都醫(yī)科大學附屬北京婦產醫(yī)院初治的宮頸鱗狀細胞癌患者的病歷資料。納入標準：經病理證實為宮頸鱗狀細胞癌。排除標準：既往有放化療史；合并心肝腎等重要臟器疾病；合并其他腫瘤。共納入35例宮頸鱗狀細胞癌患者，年齡29～71歲，中位年齡52歲；臨床分期采用國際婦產科聯(lián)盟標準：Ⅰ期14例，ⅡA期10例，ⅡB期8例，Ⅲ期2例，Ⅳ期1例；分化程度：高分化5例，中分化28例，低分化2例。取材前均經患者同意并簽署知情同意書。

1.2 主要藥物、試劑和儀器

DDP、5-FU血漿峰值濃度（peak plasma concentration，PPC）分別為：2.5μg/ml、22.5 μg/ml，根據(jù)參考文獻[4-6]提供的PPC，100%試驗藥物濃度（test drug concentrations，TDC）為PPC。聯(lián)合藥物方案中每種藥物的TDC與單藥試驗相同。

ATP-TCA法藥敏檢測試劑盒購自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術有限公司；鼠抗人P-gp、GST-π、TopoⅡ、TS單克隆抗體，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑，EnⅤision二步法試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。MPL1型生物熒光測定儀購自德國Berthold公司。

1.3 實驗方法

將新鮮宮頸癌組織分成兩部分，其中一部分行快速病理及免疫組化檢測耐藥蛋白，另一部分立即送往無菌實驗室，參考文獻[7]的實驗步驟制成單細胞懸液。將化療藥物分別設置5個稀釋濃度，分別為200%、100%、50%、25%、12.5%，稀釋至48孔板中，每孔設置2個平行孔，其余孔分別用于無藥物處理和空白對照。在每個孔中加入單細胞懸液（2～3）×104/ml，將培養(yǎng)皿置于5% CO2、37 ℃、95%以上濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。各孔加ATP提取液50 μl，混勻后取50 μl混合液于檢測板，加入50 μl熒光酶-熒光素工作液，將檢測板置于熒光檢測儀內進行檢測。熒光檢測儀自動計算每種藥物各個濃度的腫瘤生長抑制率、半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）和IC90，繪制腫瘤抑制曲線圖，從而判定藥物敏感程度。

1.4 腫瘤組織對化療藥物的敏感性檢測

評價標準參考文獻[8]。高度敏感（SS）：IC50≤25% TDC且IC90≤100% TDC；中度敏感（IS）：IC50≤25% TDC且IC90＞100% TDC；輕度敏感（MS）：IC50＞25% TDC 且 IC90≤100% TDC；耐藥（R）：IC50＞25% TDC且 IC90＞100% TDC。體外有效率=（SS+IS）/（SS+IS+MS+R）×100%。

1.5 免疫組化法檢測蛋白表達情況

采用EnⅤision二步法檢測宮頸鱗狀細胞癌中P-gp、GST-π、TS、TopoⅡ蛋白的表達情況，每批切片均設陽性對照及陰性對照，用已知P-gp、、GST-π、TS、TopoⅡ的陽性宮頸癌切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.6 免疫組化結果判定

P-gp、GST-π、TS蛋白的判定標準：“-”，陽性細胞＜10%；“+”，陽性細胞為10%～25%；“++”，陽性細胞＞25%且≤75%；“+++”，陽性細胞＞75%。TopoⅡ蛋白的判定標準：“-”，陽性細胞＜25%；“+”，陽性細胞為25%～50%；“++”，陽性細胞＞50%且≤75%；“+++”，陽性細胞＞75%。本研究以“-”為陰性，“+～+++”均為陽性。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SAS 9.4軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；多因素分析采用Logistic回歸分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ATP-TCA體外藥敏實驗結果

35例標本均進行藥敏實驗，DDP的體外有效率為37.14%（13/35），與DDP+5-FU的51.43%（18/35）比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.447，P＞0.05）（表1）。經多因素分析發(fā)現(xiàn)，患者年齡、臨床分期、分化程度均不為DDP、DDP+5-FU藥物敏感性的影響因素（P＞0.05）（表2）。

表1 宮頸鱗狀細胞癌對兩組化療藥物的體外藥敏實驗結果

表2 化療藥物敏感性影響因素的多因素分析

2.2 耐藥蛋白表達與體外藥物敏感性的關系

P-gp、GST-π、TopoⅡ、TS蛋白陽性表達率分別為57.14%（20/35）、51.43%（18/35）、71.43%（25/35）、57.14%（20/35）。GST-π蛋白陽性表達是宮頸鱗狀細胞癌對DDP耐藥的影響因素（P=0.002）；TS蛋白陽性表達是宮頸鱗狀細胞癌對DDP+5-FU耐藥的影響因素（P=0.001）；P-gp、TopoⅡ蛋白陽性表達與宮頸鱗狀細胞癌對DDP、DDP+5-FU耐藥敏感性無關（P＞0.05）。（表3）

表3 耐藥蛋白表達與DDP、DDP+5-FU藥物敏感性關系的多因素分析

3 討論

3.1 宮頸鱗狀細胞癌ATP-TCA 體外藥敏實驗的臨床意義

ATP-TCA技術是目前應用較廣泛、較成熟的一項的體外藥敏檢測方法。其原理是在生理條件下，ATP是活細胞能量代謝的來源，細胞凋亡后會迅速水解消失，而ATP在熒光素-熒光素酶復合物的作用下釋放螢光（波長為562 nm），檢測螢光強度，即可測出ATP含量即活細胞數(shù)量。研究表明，ATP-TCA的體外藥敏檢測結果與臨床療效及生存率具有較好的相關性[9]。化療前對化療藥物進行體外藥敏檢測可有效預防原代耐藥的發(fā)生和不適當藥物的治療[10-11]。本課題前期劉志茹和孔為民[12]的研究已證實ATP-TCA法用于檢測宮頸癌體外藥物敏感性具有可行性。

DDP與DDP+5-FU是臨床中晚期宮頸癌同步放化療中最常用的兩種化療方案，DDP與5-FU均具有放射增敏作用，在放化療中起到協(xié)同及互補的治療效果。DDP屬于細胞周期非特異性藥物，藥物進入細胞核作用于DNA分子后可形成Pt-DNA化合物，阻斷DNA的復制與轉錄過程，導致細胞死亡。DDP是濃度依賴性抗腫瘤藥，濃度越高，療效越好，而且在臨床上宮頸癌治療中順鉑的毒性可控[12]，較為安全。5-FU是細胞周期特異性抗代謝類抗惡性腫瘤藥物，作用于細胞S期。近年來研究發(fā)現(xiàn)5-FU在體內可轉變?yōu)?-FU脫氧核苷酸、5-FU核苷等代謝產物，從而影響或干擾DNA及蛋白質的合成，起到抗腫瘤作用。5-FU具有時間依賴性，持續(xù)給藥能提高療效。本研究結果顯示，單藥DDP體外有效率為37.14%（13/35），DDP+5-FU聯(lián)合應用體外有效率為51.43%（18/35），聯(lián)合用藥體外有效率略高于單藥，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Kim等[13]一項隨機對照試驗，比較DDP+5-FU與單藥DDP聯(lián)合放療治療局部晚期宮頸癌（ⅡB～ⅣA期）的療效，聯(lián)合組、單藥組患者3個月完全緩解率分別為96%和88%，4年總生存率分別為64%和54%，無病生存率分別為77%和66%。2級以上血液毒性發(fā)生率分別為29%和15%，兩組患者反應性、生存率和急性毒性發(fā)生率比較，無顯著差異。Kim等[14]的又一項前瞻性隨機對照研究，納入研究對象為155例局部晚期宮頸癌患者，比較DDP+5-FU與單藥DDP聯(lián)合放療治療局部晚期宮頸癌的療效，隨訪時間39個月，兩組患者的依從性分別為60%、71%，完全有效率分別為91%、91%，4年總生存率分別為70%、67%，無進展生存率分別為67%、66%，每周使用DDP周療聯(lián)合放療方案可顯著提高治療依從性，降低急性血液毒性，但不能提高生存率。Sonoda等[15]回顧性分析了91例ⅠB1～ⅣA期同步放化療的宮頸癌患者的病歷資料，比較DDP+5-FU 3周療法和DDP周療的療效，兩種方案療效相似，但DDP單藥周療的不良反應耐受較好。但是Nedovic等[16]對134例局部晚期宮頸癌患者的研究顯示，DDP+5-FU聯(lián)合放療治療比單純DDP聯(lián)合放療更有效，2年復發(fā)率低。因此還需要大樣本的前瞻性研究。

本研究發(fā)現(xiàn)DDP與DDP+5-FU體外藥物敏感性與臨床特征如患者年齡、臨床分期、分化程度無關（P＞0.05）。由于本研究樣本量偏少，統(tǒng)計結果可能出現(xiàn)偏倚，并且體外實驗腫瘤細胞所處環(huán)境單一，腫瘤細胞完全浸泡于化療藥物中，而人體內環(huán)境相對復雜，藥物入血后也產生一系列的不良反應，因此體外實驗能否真正反映體內情況還需要進一步研究。

3.2 體外藥物敏感性與耐藥蛋白P-gp、GST-、TopoⅡ、TS 表達的關系

多項研究已表明，腫瘤組織中P-gp、GST-π、TS及TopoⅡ的表達與腫瘤耐藥密切相關，其中以MDR1基因編碼的P-gp就是一種多藥耐藥蛋白。Penson等[17]研究發(fā)現(xiàn)P-gP的高表達與腫瘤患者的生存率呈明顯負相關。TopoⅡ是一種重要的核酶，能切斷超螺旋狀態(tài)的DNA雙鏈，改變DNA拓撲學結構，參與DNA復制、轉錄、翻譯等生理功能。TopoⅡ是腫瘤化療過程中重要的靶酶，高表達對化療藥物敏感，低表達使細胞毒性降低，甚至耐藥。本實驗結果顯示，P-gp、GST-π、TopoⅡ、TS蛋白陽性表達率分別為57.14%（20/35）、51.43%（18/35）、71.43%（25/35）、57.14%（20/35）。由此可見宮頸癌組織在未接受化療前已產生耐藥蛋白，說明宮頸癌組織本身存在一種或多種耐藥機制。本研究對象對TopoⅡ介導的原發(fā)耐藥相對偏低，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，P-gp、TopoⅡ蛋白表達與宮頸鱗狀細胞癌對DDP、DDP+5-FU耐藥無關（P＞0.05）。

GST-π主要功能為保護氧化劑對巰基的氧化，保護細胞膜中含巰基的蛋白質和酶不被破壞。目前越來越多的證據(jù)支持，GST-π在多種腫瘤中過表達，如非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、結腸癌、卵巢癌等。研究發(fā)現(xiàn)[18]谷胱甘肽對DDP有解毒功能，也是使其耐藥的原因之一。本實驗分析發(fā)現(xiàn)GST-π蛋白高表達與宮頸癌DDP耐藥有關。因此推斷GST-π蛋白表達可能是導致宮頸癌對DDP耐藥的重要原因。TS是DNA合成所必需的酶，5-FU是通過對TS蛋白的抑制而發(fā)揮其抗癌活性。研究發(fā)現(xiàn)[19]，TS的高表達與氟尿嘧啶耐藥有關，5氟尿嘧啶就是通過對TS蛋白的抑制而發(fā)揮其抗癌活性。Oguri等[20]研究發(fā)現(xiàn)，TS和細胞內代謝酶的表達與5-FU的敏感性和（或）耐藥性有關。本研究結果也顯示，TS蛋白的表達與DDP+5-FU的耐藥有關。因此推斷，TS蛋白高表達可能是導致宮頸癌對DDP+5-FU耐藥的重要原因。

綜上所述，中晚期宮頸癌同步放化療中常用的兩組化療方案DDP及DDP+5-FU的ATP-TCA法體外有效率無顯著差異。研究組還將繼續(xù)進行體內的研究及大樣本的臨床病例的回顧性及前瞻性對比觀察。GST-π、TS耐藥蛋白陽性表達可用于臨床宮頸鱗狀細胞癌患者對DDP、5-FU化療耐藥的預測指標，從而避免盲目用藥，造成醫(yī)療資源浪費及產生不必要的化療不良反應。