巖白菜素新穎衍生物合成及其鎮咳祛痰活性

周金娜，張榮平，鄒 澄，楊為民，何 波，陳德云，段文越

（昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南昆明 650500）

巖白菜素（Bergenin）作為天然的次生代謝產物，來源于多種植物。巖白菜素屬二氫異香豆素類化合物，過去尚有巖白菜內酯，鬼燈聚素，巖白菜寧，佛手配質等異名，溶解性極差[1]。現代藥理研究證實巖白菜素具有抗炎，抗腫瘤，抗心律失常，鎮咳祛痰等活性[2-5]。巖白菜素的藥代動力學研究表明其生物利用度較低，為了充分發揮巖白菜素的藥用價值，提高其生物利用度以及生物活性，不少研究者對巖白菜素進行結構改造[6-11]，其中，通過Mannich 反應合成的化合物能增加巖白菜素的水溶性及其活性。因此，本文將巖白菜素與芳基重氮鹽反應生成新穎偶氮衍生物，且根據重氮化偶合反應機理，針對巖白菜素分子中苯環的7 位進行結構修飾，生成巖白菜素偶氮衍生物。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22 g。由昆明醫科大學動物實驗中心提供。

FA2004 電子天平（上海瞬宇恒平科學儀器有限公司），BUCHIR-200 旋轉蒸發儀（瑞士BUCHI公司），KQ-100E 型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SHZ-DⅢ水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司），DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司），BrukerAVⅢ-500 型核磁共振波譜儀（美國Bruker公司），安捷倫6520 系列高分辨Q-TOF-ESI-MS（安捷倫科技有限公司）。

柱層析用硅膠（青島海洋化工廠）；高效薄層層析板（默克）；化學合成試劑主要為優級純，少量分析純，均購買于上海晶純實業有限公司（阿拉丁）和上海泰坦科技股份有限公司（阿達瑪斯）。

1.2 方法

1.2.1 7-氨基巖白菜素的制備取50 mg 已制備好的7-對苯砷酸偶氮巖白菜素[11]置于50 mL 雙口圓底燒瓶，加入5 mL 甲醇超聲溶解，溶解完全后常溫攪拌條件下加入100 g 鋅粉，通入惰性氣體氬氣保護反應進行，另外稱取150 mg 甲酸銨，加入5 mL 甲醇超聲溶解完全后在真空條件下將甲酸銨溶液用10 mL 注射器吸取甲酸銨溶液注射于雙口圓底燒瓶中反應，每隔0.5 h 用碘顯色和薄層色譜（TLC）檢查反應終點。2 h 反應完全后常溫過濾，減壓蒸餾濾液，經300～400 目硅膠柱色譜分離，使用氯仿:乙醇（17:3）進行洗脫，得到化合物1，采用核磁共振對其進行結構鑒定。化合物1 反應途徑見圖1。

圖1 7-氨基巖白菜素的合成Fig.1 Preparation of 7-amino bergenin

1.2.2 鎮咳活性評價取小鼠32 只，雌雄各半，隨機分成4 組（空白組、模型組、供試藥組、和巖白菜素組），每組8 只。實驗前小鼠禁食不禁水12 h，各組均灌胃給藥（巖白菜素劑量100 mg/kg），給藥1 h 后，將小鼠置于倒置的500 mL燒杯內，用1 mL 注射器吸取濃氨水（25%～28%）0.15 mL 注入燒杯內放的棉球中觀察小鼠出現咳嗽的時間（咳嗽潛伏期）和3min 內咳嗽次數（以小鼠腹肌收縮或縮胸，同時張嘴為咳嗽指標）。

1.2.3 祛痰活性評價取小鼠36 只，雌雄各半，隨機分成3 組（生理鹽水組，巖白菜素組，供試藥組），每組12 只。實驗前禁食不禁水12 h。分別灌胃給予藥物組和巖白菜素（100 mg/kg）及生理鹽水（1 mL/200 g）。給藥后0.5 h，腹腔注射0.5%酚紅溶液0.5 mL，30 min 后處死小鼠（盡量不損傷氣管），仰位固定于手術板上，剪開頸正中皮膚，分離氣管，在氣管下穿一絲線，用8 號針頭于喉頭下插入氣管內0.3 cm，絲線結扎固定，用1 mL 注射器吸取0.5 mL 的5%NaHCO3溶液來回灌洗呼吸道3 次，將灌洗液注入一比色管中，重新吸取5%NaHCO3溶液0.5 mL 如上再灌洗3 次，再同樣灌洗3 次，如此共抽洗9 次，合并洗出液，離心10 min，取上清液，用分光光度計在波長546 nm 處測OD 值，從標準曲線上計算出酚紅排出量（μg/mL），并與對照組相比。

酚紅標準曲線的測定:分別配制標準濃度酚紅溶液，以分光光度計測定吸光度（A），以A 對酚紅含量C 回歸，算得回歸方程。

1.3 統計學處理

實驗結果均使用SPSS 采用單因素方差分析進行處理，結果以（）表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 波譜數據

化合物1，淡黃色油狀物，分子式為C14H17NO9。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：4.97（1H，d，H-10b）; 4.86 （1H，m，H-4a）; 4.03（1H，m，H-4）; 3.98 （1H，m，H-2）; 3.79（1H，m，H-9-OCH3）,3.67 （1H，m，H-11）;3.40 （1H，m，H-3）; 13C-NMR（CD3OD，125MHz）δ：80.69 （C-2），74.86 （C-3），75.81（C-4），167.92 （C-6），139.09 （C-7），112.25（C-8），142.07（C-9），139.80 （C-10），62.73（C-11），82.87 （C-4a），98.89 （C-6a），111.01（C-10a），60.97 （9-OCH3）71.88 （C-10b），ESI-MS （m/z）:344.10 [M+H]+。經分析確定為7-氨基巖白菜素。

2.2 鎮咳活性

各組小鼠咳嗽潛伏期比較差異無統計學意義（P>0.05）；與空白組相比，模型組3 min 內的咳嗽次數顯著增加，顯示造模成功。與模型組相比，供試藥組小鼠3 min 內咳嗽次數顯著降低（P<0.01）；同時，與巖白菜素組相比，供試藥組小鼠3min 內咳嗽次數降低（P<0.01），以上結果表明，7-氨基巖白菜素具有鎮咳活性，見表1。

2.3 祛痰活性

祛痰活性的比較顯示，施加7-氨基巖白菜素后的祛痰活性均顯著優于生理鹽水組（P<0.01）；另外，與巖白菜素組相比，供試藥組小鼠氣管酚紅排出量同樣明顯增加（P< 0.05），以上結果表明，巖7-氨基巖白菜素具有顯著祛痰活性，見表2。

表1 7-氨基巖白菜素對小鼠的鎮咳活性比較（）Tab.1 A comparison of antitussive effect of 7-amino bergenin on mice （）

表1 7-氨基巖白菜素對小鼠的鎮咳活性比較（）Tab.1 A comparison of antitussive effect of 7-amino bergenin on mice （）

與模型組比較，**P<0.01，與巖白菜素組比較，##P<0.01。

表2 7-氨基巖白菜素對小鼠的祛痰活性比較（）Tab.2 A comparison of expectorant effect of 7-amino bergenin on mice （）

表2 7-氨基巖白菜素對小鼠的祛痰活性比較（）Tab.2 A comparison of expectorant effect of 7-amino bergenin on mice （）

與生理鹽水組比較，**P<0.01，與巖白菜素組比較，#P<0.05。

3 討論

利用偶氮還原方法對巖白菜素偶氮衍生物進行還原，使氮-氮鍵斷裂而生成氨基巖白菜素，這種方法不僅具有步驟少、反應條件溫和的優點，而且氨基的引入也可能增加巖白菜素的溶解度，從而提高生物利用度、增強其藥理活性。

在設計還原巖白菜素偶氮衍生物中，根據巖白菜素偶氮衍生物及實驗室的條件筆者嘗試使用水合肼（N2H4·H2O）做供氫體，鈀碳（Pb/C）為催化劑在80℃下進行還原，但該還原反應速度極慢，產率極低；也嘗試使用硫代硫酸鈉（Na2S2O3）在稀NaOH（2 mol/L）條件下進行還原，該還原反應速度較快，但反應溶液放置后接觸空氣后變色氧化，最終我們采取了以甲酸銨作為供氫體、鋅粉（Zn）提供電子在甲醇中還原巖白菜素偶氮衍生物，該方法操作方便、簡單、原子經濟性高且反應基團專一。

研究證實巖白菜素具有鎮咳祛痰的藥理作用[12-14]，研究大多利用氨水引咳法和氣管酚紅排泌法來觀察巖白菜素對小鼠的鎮咳祛痰活性[15-16]，方法較為成熟，且容易操作。通過氨基的引入所得到的衍生物7-氨基巖白菜素，具有顯著的鎮咳祛痰活性。與巖白菜組相比，無論是鎮咳活性或者是祛痰活性，供試藥組均顯示出較好活性，這為巖白菜素的鎮咳祛痰活性研究提供了的新的研究基礎，也為后續的巖白菜素結構修飾提供了新的研究方向。