亞麻籽餅粕中木酚素的微波輔助提取工藝及抗氧化活性研究

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林132101）

亞麻是亞麻科、亞麻屬一年生或多年生的十大油 料作物之一，也叫胡麻[1]，亞麻籽餅粕是榨油后剩余的副產(chǎn)物，傳統(tǒng)的亞麻籽只限于榨油，剩余的副產(chǎn)物只用作動(dòng)物飼料或廢物處理，沒(méi)有得到充分的開(kāi)發(fā)和利用。亞麻籽餅粕中含有的營(yíng)養(yǎng)成分包括亞麻蛋白、膳食纖維和木酚素等[2-3]。木酚素類(lèi)物質(zhì)主要包括開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚（secoisolariciresinol，SECO）和其糖苷開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚二葡萄糖苷（secoisolariciresinol diglucoside，SDG）等。其中SECO占到木酚素的62%，但通常以SDG這種最主要的活性成分形式存在[4-5]。SDG是一種植物激素，與人體的雌激素十分相似，具有抑制人體乳癌細(xì)胞生長(zhǎng)、預(yù)防前列腺癌、經(jīng)期綜合癥、骨質(zhì)疏松等作用[6-7]。亞麻籽餅粕中高純度的木酚素具有抗氧化性和很好的藥用前景，其活性和藥性顯著主要表現(xiàn)在對(duì)糖尿病、冠心病、胃腸腫瘤等。木酚素也可以作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品中[8]，開(kāi)發(fā)利用亞麻籽餅粕中的木酚素具有廣闊的市場(chǎng)前景。

亞麻籽餅粕中存在的這種活性成分SDG是與一些不確定成分結(jié)合成為絡(luò)合物，傳統(tǒng)的超臨界流體萃取、有機(jī)溶劑、酶法、超聲波輔助提取[9]等卻忽略這一點(diǎn)，造成提取不充分或得率低。微波輔助提取技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、溶劑消耗量低、節(jié)省時(shí)間、效率高等優(yōu)點(diǎn)[10-11]，可以解決傳統(tǒng)方法存在的問(wèn)題，因此被廣泛應(yīng)用于天然植物活性成分的提取工藝。本試驗(yàn)應(yīng)用響應(yīng)面分析法，對(duì)亞麻籽餅粕中的木酚素進(jìn)行微波輔助提取的工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而得到最佳的提取工藝，并研究它的抗氧化性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑尋找最佳技術(shù)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

亞麻籽餅粕：內(nèi)蒙古蒙谷香生物科技有限公司；SECO標(biāo)品：上海江萊生物科技有限公司，純度98%以上；正己烷、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、醋酸纖維素膜、正丁醇、甲醇、磷鉬酸、Na2HPO4、NaH2PO4、H2O2、VC、Tris-HCl、鄰苯三酚、DPPH標(biāo)準(zhǔn)品：西亞化學(xué)科技（山東）有限公司。

1.2 儀器

多功能高速粉碎機(jī)（HR-03）：上海哈瑞斯電器有限公司；微波合成反應(yīng)儀（MCR-3）：鞏義市予華儀器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1700）：山海美析儀器有限公司；臺(tái)式離心機(jī)（KH19A）：湖南凱達(dá)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A）：上海亞榮生化儀器廠；恒溫水浴鍋（HHS-6）：成都臻通貿(mào)易有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 工藝流程

亞麻籽餅粕→粉碎→過(guò)篩→脫脂→離心→烘干→加入提取劑→預(yù)浸攪拌→微波輔助提取→離心→堿解→調(diào)pH值→微濾→萃取→減壓濃縮→復(fù)溶→純化→測(cè)定

2.2 木酚素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用磷鉬酸顯色法測(cè)定[12]。開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇將其溶解，配成濃度為11.65 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)液 0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL至20mL的刻度試管中，分別加入3倍體積的5%磷鉬酸乙醇溶液，80℃水浴加熱，除去溶劑，升溫至100℃，再加熱15 min，冷水冷卻，依次加入蒸餾水10 mL，上下振搖使其完全溶解。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定，確定最大吸收波長(zhǎng)，在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定各處理的吸光度值，以濃度對(duì)吸光度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 亞麻籽餅粕木酚素的提取

亞麻籽餅粕粉碎，過(guò)100目篩，取100 g加入1∶5（g/mL）的正己烷于 24℃下攪拌，脫脂 15 h，4 000 r/min離心20 min，棄去上清液，脫脂粉末移入平皿中，入鼓風(fēng)干燥箱中干燥，40℃60 min。取亞麻籽餅粕脫脂粉5 g按一定比例加入提取劑乙醇，注意溶液不要超過(guò)500 mL，攪拌，調(diào)節(jié)微波功率和時(shí)間進(jìn)行微波萃取，測(cè)量醇提液的體積，4 000 r/min離心20 min，配制1mol/LNaOH溶液進(jìn)行堿解，使醇提液中NaOH的濃度調(diào)至0.25 mol/L（3份醇提液+1份NaOH），1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為4.0，用0.45 μm的醋酸纖維素膜進(jìn)行微濾[13-14]。加入水飽和的正丁醇溶液萃取3次[15]，合并正丁醇相，減壓濃縮除去正丁醇。根據(jù)以下公式計(jì)算得率。

式中：Y為亞麻籽餅粕木酚素得率，mg/g；Ms為提取液中亞麻籽餅粕木酚素質(zhì)量，mg；Mc為脫脂亞麻籽餅粕的質(zhì)量，g。

2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 乙醇濃度對(duì)木酚素得率的影響

固定微波時(shí)間為2 min，微波功率為300W，料液比為1∶20（g/mL），分別設(shè)置乙醇濃度為30%、40%、50%、60%及70%，以亞麻籽餅粕中木酚素得率為指標(biāo)，按照上述操作方法，確定最適乙醇濃度。

2.4.2 微波時(shí)間對(duì)木酚素得率的影響

固定乙醇濃度，微波功率為300 W，料液比為1 ∶20（g/mL），分別設(shè)置微波時(shí)間為 1、1.5、2、2.5 min 及3 min，以亞麻籽餅粕中木酚素得率為指標(biāo)，按照上述操作方法，確定微波的最佳時(shí)間。

2.4.3 微波功率對(duì)木酚素得率的影響

固定乙醇濃度、微波時(shí)間，料液比為 1∶20（g/mL），分別設(shè)置微波功率為200、250、300、350 W及400 W，以亞麻籽餅粕中木酚素得率為指標(biāo)，按照上述操作方法，確定微波的最佳功率。

2.4.4 料液比對(duì)木酚素得率的影響

固定乙醇濃度、微波時(shí)間、微波功率，分別設(shè)置料液比為 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）[16]，以亞麻籽餅粕中木酚素得率為指標(biāo)，按照上述操作方法，確定最適料液比。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)來(lái)設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，確定四因素（乙醇濃度A、微波時(shí)間B、微波功率C、料液比D）三水平，進(jìn)行響應(yīng)面交互作用分析。研究不同因素對(duì)亞麻籽餅粕中木酚素得率的影響，確定最佳工藝條件和最大得率。

2.6 亞麻籽餅粕木酚素提取的抗氧化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.6.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[17-18]方法進(jìn)一步改進(jìn)。取250mgDPPH固體用乙醇溶解，配成濃度為250 mg/L溶液備用。取20 mL比色管6支，第1支加入250 mg/L DPPH乙醇溶液4 mL和95%乙醇1.0 mL，搖勻，參比溶液用95%乙醇，波長(zhǎng)調(diào)至515 nm，測(cè)定吸光度值記做A0，其余5支比色管分別加入95%乙醇4 mL和不同濃度（50、100、150、200、250 mg/L）的待測(cè)試樣 1.0 mL，測(cè)定吸光度值記做Ar，最后取比色管加入250 mg/L DPPH乙醇溶液4.0 mL和1.0 mL待測(cè)試樣，測(cè)定吸光度值，記做AS。VC溶液作為其抗氧化性的對(duì)照試驗(yàn)。清除率計(jì)算見(jiàn)式（1），根據(jù)SPSS Statistics 26軟件計(jì)算IC50值，值越小，清除自由基能力越強(qiáng)，抗氧化能力就越強(qiáng)。

式中：AS為DPPH乙醇溶液+待測(cè)試樣的吸光度；Ar為95%乙醇溶液+待測(cè)試樣的吸光度；A0為DPPH乙醇溶液+95%乙醇溶液的吸光度。

2.6.2 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

采用鄰苯三酚氧化法[19]進(jìn)行測(cè)定：在20 mL比色管中分別加入Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2）3 mL，和不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L 及 1.0 mg/L）的樣品液1 mL，并置于恒溫水浴鍋中加熱，25℃加熱20 min，比色管中再加入7.0 mol/L的鄰苯三酚0.3 mL再反應(yīng)4 min，加入10 mol/L的HCl 1 mL使反應(yīng)結(jié)束，420 nm處，測(cè)定吸光度值A(chǔ)，按照上述操作方法，不加樣品進(jìn)行測(cè)定吸光度值A(chǔ)0，測(cè)定樣品本身的吸光度值記做A1。VC溶液作對(duì)照，清除率計(jì)算見(jiàn)式（2），SPSS Statistics 26軟件計(jì)算IC50值。

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；A為樣品組的吸光度；A1為樣品溶液本身的吸光度。

2.6.3 ·OH清除率的測(cè)定

對(duì)照文獻(xiàn)[20]的方法加以改進(jìn)。配制0.2 mol/L pH 4的磷酸鹽緩沖溶液100 mL，取10.21 mL 30%的H2O2加入緩沖鹽溶液89.79 mL，配成含有磷酸鹽緩沖溶液的10 mol/L的H2O2溶液。取5 mL置于20 mL比色管中，加入樣品液5 mL，樣品液配成不同濃度50、100、150、200、250 mg/L?；旌暇鶆颍ㄩL(zhǎng)調(diào)至 230 nm處，測(cè)定吸光度值A(chǔ)1。另取兩支比色管，一支不加樣品液，另一支不加H2O2，波長(zhǎng)相同下測(cè)定吸光度值記做A0和A2，各管用水定容。VC溶液作對(duì)照，清除率計(jì)算見(jiàn)式（3），SPSS Statistics 26軟件計(jì)算IC50值。

式中：A0為不加樣品液的H2O2溶液的吸光度；A1為樣品液的吸光度；A2為不加H2O2溶液的樣品液的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 木酚素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

磷鉬酸顯色法測(cè)定亞麻籽餅粕中木酚素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 磷鉬酸顯色法測(cè)定亞麻籽餅粕中木酚素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for determination of flaxseed cake lignan

亞麻籽餅粕中木酚素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.206 7X-0.009 2，R2為0.995 1，說(shuō)明了相關(guān)度較高，木酚素的含量可以通過(guò)此標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

3.2 亞麻籽餅粕木酚素提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 乙醇濃度對(duì)木酚素得率的影響

乙醇濃度對(duì)木酚素得率的影響見(jiàn)圖2。

從圖2可以看出，隨著乙醇濃度的增加，木酚素得率先升高后下降，濃度由30%變化到60%時(shí)得率增加，60%時(shí)出現(xiàn)峰值，得率最高，超過(guò)60%時(shí)得率會(huì)下降，原因是乙醇濃度過(guò)高會(huì)使一些醇溶性雜質(zhì)色素和親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加。所以乙醇濃度選擇60%最適。

圖2 乙醇濃度對(duì)木酚素得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on lignan yield

3.2.2 微波時(shí)間對(duì)木酚素得率的影響

微波時(shí)間對(duì)木酚素得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 微波時(shí)間對(duì)木酚素得率的影響Fig.3 Effect of microwave time on lignan yield

從圖3可以看出，隨著微波時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，木酚素得率先升高后下降，1.5 min時(shí)得率最高，超過(guò)1.5 min會(huì)溶出少量的亞麻膠，溶液黏度增加，使木酚素溶出受阻，也會(huì)由于時(shí)間太長(zhǎng)造成容器炸裂。所以微波時(shí)間選擇1.5 min最為合適。

3.2.3 微波功率對(duì)木酚素得率的影響

微波功率對(duì)木酚素得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 微波功率對(duì)木酚素得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on lignan yield

從圖4可以看出，微波功率由200 W到300 W時(shí)，木酚素得率逐漸上升，在300 W時(shí)出現(xiàn)峰值，超過(guò)300 W時(shí)得率逐漸下降，原因是功率過(guò)大會(huì)造成反應(yīng)劇烈，破壞木酚素成分，使得率降低。所以選擇300 W功率較好。

3.2.4 不同料液比對(duì)木酚素得率的影響

料液比對(duì)木酚素得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 料液比對(duì)木酚素得率的影響Fig.5 Effect of feed liquid ratio on lignan yield

從圖5可以看出，隨著溶劑體積增加，得率先增加后降低，在1∶20（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值，溶劑體積增加，得率下降的原因是溶劑過(guò)量不能將木酚素的細(xì)胞壁破碎，微波作用不完全，成本也會(huì)增加，綜合考慮選擇 1∶20（g/mL）時(shí)最為合適。

3.3 亞麻籽餅粕木酚素提取的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果分析

3.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果得出4個(gè)因素的最大取值，進(jìn)一步進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。響應(yīng)面分析法的因素水平見(jiàn)表1，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 響應(yīng)面分析法的因素與水平表Table 1 Factors and level tables of response surface analysis

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Response surface test results

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Response surface test variance analysis

使用最新版Design Expert V 8.0.6響應(yīng)面軟件進(jìn)行分析，得到亞麻籽餅粕木酚素提取的4個(gè)因素的二次回歸模型：木酚素得率=14.74+0.71A+0.23B+0.59C+0.35D-0.66AB+0.43AC+0.23AD-0.60BC-0.59BD-0.82CD-0.94A2-0.74B2-0.95C2-0.21D2

由表3可以看出，模型的F值為31.76，P＜0.000 1，說(shuō)明模型的可信度較高，能正確的反應(yīng)出4個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系變化，R2=0.969 5，接近于1，Radj=0.939 0，說(shuō)明二次多項(xiàng)式方程能夠充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，且擬合程度較好。4個(gè)因素對(duì)木酚素得率的顯著性也可以根據(jù)P值來(lái)判斷大小，P＜0.01，說(shuō)明對(duì)木酚素得率影響極顯著，如果P＜0.05則影響顯著，軟件中的A、C、CD、A2、B2、C2表現(xiàn)為差異極顯著，B、D、AB、AC、BC、BD表現(xiàn)為差異顯著。由A、B、C、D的F值大小可以得出各因素對(duì)木酚素得率的影響順序?yàn)锳＞C＞D＞B。

響應(yīng)面曲面分析見(jiàn)圖6。

圖6 兩兩因素交互作用的響應(yīng)面Fig.6 Response surface of the effect interaction of two factors

通過(guò)觀察等高線形狀和坡面陡峭程度來(lái)判斷每?jī)蓚€(gè)因素相互作用是否顯著。如果是橢圓形且坡面越陡峭，表示兩因素交互作用顯著，對(duì)得率影響較大，如果是圓形，表示兩因素交互作用不顯著，由圖6可知，CD交叉作用最顯著，其次是AB和BC的交互作用較顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。通過(guò)方差結(jié)果得出4個(gè)因素對(duì)得率的影響順序是：乙醇濃度＞微波功率＞料液比＞微波時(shí)間。

3.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design Expert V 8.0.6響應(yīng)面軟件，根據(jù)回歸模型預(yù)測(cè)亞麻籽餅粕中木酚素最佳提取工藝為：乙醇濃度60.08%，微波時(shí)間1.47 min，微波功率300.44 W，料液比1∶20（g/mL），此時(shí)木酚素的理論得率為14.82 mg/g。根據(jù)預(yù)測(cè)條件和實(shí)際操作所得到的木酚素提取最優(yōu)工藝條件為：乙醇濃度60%，微波時(shí)間1.5 min，微波功率 300 W，料液比 1 ∶20（g/mL），按照此工藝條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得亞麻籽餅粕的平均木酚素得率為14.74 mg/g，實(shí)測(cè)結(jié)果和預(yù)測(cè)結(jié)果接近，表明該模型的擬合程度較好，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，能夠更好地描述響應(yīng)面法優(yōu)化木酚素得率隨提取條件的變化規(guī)律。因此，該模型具有可行性。

3.4 亞麻籽餅粕木酚素抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

不同濃度亞麻籽餅粕木酚素與VC對(duì)DPPH自由基的清除效果見(jiàn)圖7，不同濃度亞麻籽餅粕木酚素與VC對(duì)O2-·的清除效果見(jiàn)圖8，不同濃度亞麻籽餅粕木酚素與VC對(duì)·OH的清除效果見(jiàn)圖9。

圖7 不同濃度亞麻籽餅粕木酚素與VC對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.7 Different concentrations，lignans and flaxseed cake VC DPPH free radical scavenging effect

圖8 不同濃度亞麻籽餅粕木酚素與VC對(duì)O2-·的清除效果Fig.8 Different concentrations，lignans and flaxseed cake VCto O2-·scavenging effect

圖9 不同濃度亞麻籽餅粕木酚素與VC對(duì)·OH的清除效果Fig.9 Different concentrations，lignans and flaxseed cake VCto·OH scavenging effect

從圖7～圖9可以看出，隨著濃度的增加，清除率逐漸增加，并與VC進(jìn)行對(duì)比結(jié)果顯示，木酚素和VC都具有較好的清除能力，圖7木酚素IC50值為94.629 mg/L，VC的IC50值為102.755 mg/L，圖 8木酚素IC50值為0.253 mg/L，VC的IC50值為0.8928 mg/L，圖9木酚素IC50值為 91.558 mg/L，VC的 IC50值為 103.155 mg/L，清除能力都大于VC，這可能是由于它們的結(jié)構(gòu)中都含有酚羥基，能夠與自由基反應(yīng)生成一個(gè)相對(duì)較大的共軛體系，因此自由基電子是相對(duì)穩(wěn)定和分散的，能夠使亞麻籽餅粕顯示出良好的抗氧化活性。

4 結(jié)論

通過(guò)本試驗(yàn)研究，探索出一種從亞麻籽餅粕中提取木酚素的新方法，利用微波輔助法從亞麻籽餅粕中提取木酚素的最佳工藝條件為：乙醇濃度60%，微波時(shí)間 1.5 min，微波功率 300 W，料液比 1 ∶20（g/mL），木酚素得率為14.74 mg/g，亞麻籽餅粕木酚素具有較高的 DPPH 自由基、O2-·、·OH 清除能力，IC50值分別為94.629、0.253 mg/L 及 91.558 mg/L，且均優(yōu)于 VC。在濃度為250 mg/L和1 mg/L時(shí)，清除率達(dá)到76.28%、89.94%及86.38%。生物活性物質(zhì)木酚素可以作為天然抗氧化劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)和利用，為下一步在食品、生物醫(yī)藥領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。