HPLC法測定地耳草中槲皮苷和異槲皮苷含量的不確定度評定

鄧祖磊,洪秋菊,崔 田

(1 蚌埠市食品藥品檢驗中心,蚌埠 233000;2 蘭州職業(yè)技術學院生物工程系;*通訊作者,E-mail:yinhua625@163.com)

不確定度是評定測定結果準確性的評估參數(shù),體現(xiàn)測量結果的可疑程度,反映測量過程中對測量結果有影響的隨機效應和系統(tǒng)效應[1],在分析測試中具有重要作用。地耳草藥材為藤黃科植物地耳草(HypericumjaponicumThunb.ex Murray)的干燥全草,具有清熱解毒、利濕消腫、散瘀止痛等功效,用于治療濕熱黃疸、痢疾、泄瀉、急性腎炎、瘡痂癰腫、血吸蟲病等[2]。現(xiàn)代研究表明,地耳草具有抗腫瘤、保肝、抑菌等作用[3],黃酮化合物是其主要活性成分[4],其中槲皮苷及其異構體異槲皮苷含量較高[5]。槲皮苷及異槲皮苷可能是地耳草抗腫瘤、保肝的物質基礎[6-8],《安徽省飲片炮制規(guī)范》(2005年版)收載有地耳草[9],但該標準較簡單,僅有性狀和一個化學鑒別項,不能全面控制藥材質量,參考文獻[10]建立地耳草中槲皮苷、異槲皮苷的HPLC法測定含量,同時參考《藥品檢測結果不確定度指導原則(中國藥典2020年版第二次征求意見稿)》、《化學分析中不確定度的評估指南》[11]及相關文獻[12-16],對已建立的地耳草中槲皮苷和異槲皮苷含量測定HPLC法進行不確定度分析及評定,為測量結果的準確性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司,配有四元梯度泵、DAD檢測器和Agilent chemstation數(shù)據(jù)系統(tǒng));C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm;月旭科技(上海)股份有限公司)、BS210S電子天平(德國賽多利斯儀器有限公司)、CP225D電子天平(德國賽多利斯儀器有限公司)、BGZ-246電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)。

1.2 藥品與試劑

槲皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:111538-201105,純度:92.7%)、異槲皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:111809-201403,純度:92.9%)、乙腈(色譜純,美國天地有限公司,批號:13045013)、甲醇(色譜純,美國天地有限公司,批號:14090484)、冰醋酸(分析純,國藥集團化學試劑有限公司)、超純水。地耳草(來源:亳州三義堂藥業(yè)有限公司;批號:20151102;產地:江西)由蚌埠市食品藥品檢驗中心副主任中藥師崔田鑒定為藤黃科植物地耳草(HypericumjaponicumThunb.ex Murray)的全草。留樣憑證標本存于蚌埠市食品藥品檢驗中心標本室。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜條件:色譜柱為月旭C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈-2.5%冰醋酸(19 ∶81);檢測波長355 nm。進樣量10μl。

系統(tǒng)適用性:二者理論板數(shù)均大于3 000,分離度大于1.5,符合藥典要求。

1.3.2 對照品溶液制備 精密稱取槲皮苷23 mg、異槲皮苷對照品12 mg,分別置20 ml容量瓶中,用80%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品貯備液。分別吸取槲皮苷、異槲皮苷對照品貯備液1.0 ml,置20 ml容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液制備 取本品粉末(過三號篩)約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50 ml 80%甲醇,稱定質量,加熱回流1 h,放冷,再稱定質量,用80%甲醇補足減失的質量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

2 結果

2.1 數(shù)學模型建立與不確定度來源分析

按外標法建立槲皮苷、異槲皮苷含量測定公式:

式中MR:對照品稱樣量;η:對照品純度;AR:對照品峰面積;M0:稱量瓶的質量;M1:烘干前的樣品與稱量瓶的質量;M2:烘干后的樣品與稱量瓶的質量;MS:供試品稱樣量。

根據(jù)上述公式,可以分析得出,含量測定的不確定度來源于對照品的純度及稱樣量、烘干前后的樣品與稱量瓶的質量、稱量瓶的質量、對照品及供試品稀釋體積、對照品及供試品色譜圖中同一成分的峰面積。此外,供試品和對照品峰面積的重復性等也是不確定度的來源。

由上述分析將槲皮苷及異槲皮苷含量測定的相對不確定度表達為:

2.2 不確定度各分量的評定

2.2.6 對照品色譜峰引入的不確定度μrel(AR)精密稱取對照品1份,平行進樣5次,記錄色譜圖(見圖1)。槲皮苷5次色譜峰面積分別為2 075.30,2 061.50,2 065.31,2 060.26,2 079.63,異槲皮苷5次色譜峰峰面積分別為1 157.70,1 145.00,1 151.30,1 150.23,1 152.23,平均峰面積分別為As1=2 068.40和As2=1 151.35。采用極差法計算,極差分別為Rq=19.37和Riq=12.7。當n=5時,極差系數(shù)2.33。槲皮苷與異槲皮苷對照品色譜峰峰面積引入的相對不確定度分別為:

圖1 對照品溶液槲皮苷、異槲皮苷色譜圖Figure 1 Chromatogram of reference solutions of isoquercitrin,quercitrin

2.2.7 供試品色譜峰引入的不確定度μrel(AS)采用雙樣平行法測定,每份供試品溶液進樣2次,色譜圖見圖2。供試品溶液1的槲皮苷、異槲皮苷色譜峰峰面積分別為1 403.50,1 401.90,722.30,717.20。供試品1中槲皮苷、異槲皮苷的極差分別為Rq1=1.6和Riq1=5.1,平均值分別為1 402.70和719.75。供試品溶液2的槲皮苷、異槲皮苷色譜峰峰面積分別為1 377.20,1 375.10,712.80和706.20,兩者的極差值分別為Rq2=2.1和Riq2=6.6,平均峰面積分別為1 376.15和709.50。采用極差法計算[1],當n=2時,極差系數(shù)C=1.33,槲皮苷與異槲皮苷對照品色譜峰峰面積引入的相對不確定度分別為:

圖2 供試品溶液色譜圖Figure 2 Chromatogram of sample solution of Hypericum japonicum Thunb.ex Murray

供試品引入的相對不確定度分別為:

2.3 不確定度各分量的相對標準不確定度統(tǒng)計與標準合成不確定度擴展不確定度的計算

不確定度各分量的相對標準不確定度統(tǒng)計結果見表1,2。

表1 槲皮苷的相對不確定度各分量表Table 1 Relative uncertainty of each component for quercitrin

表2 異槲皮苷的相對不確定度各分量表Table 2 Relative uncertainty of each component for isoquercitrin

根據(jù)上述計算結果,按公式③計算槲皮苷、異槲皮苷的標準不確定度分別為:

實驗中,按外標法計算,該批地耳草樣品的槲皮苷和異槲皮苷含量分別0.40%和0.39%,因此,槲皮苷和異槲皮苷的合成不確定度分別為:μq=0.40%×6.32×10-2=2.53×10-4,μiq=0.39%×1.17×10-1=4.56×10-4。選擇包含因子k=2,置信概率為95%時[15],則槲皮苷、異槲皮苷的擴展不確定度分別為Uq=2×2.53×10-4=5.06×10-4,Uiq=2×4.56×10-4=9.12×10-4。因此,地耳草中槲皮苷和異槲皮苷的含量測定結果分別為(0.40±0.05)%和(0.39±0.09)%,k=2。

3 討論

從相對不確定度分量表1,2中可以看出,地耳草中槲皮苷含量測定不確定度的主要來源于對照品稱量,高效液相色譜儀和對照品、樣品溶液的稀釋對不確定度貢獻也較大,異槲皮苷含量測定不確定度的主要來源與槲皮苷類似,但供試品峰面積對其不確定度貢獻也較大,而對照品純度和水分對二者不確定度貢獻相對較小。

不確定度評定結果提示在實際檢驗操作過程中,首先要保證實驗儀器、計量器具等均應計量檢定合格,并注意維護和保養(yǎng),對照品稱量應選擇合適量程及精度的電子分析天平,以提高稱量的靈敏度和準確性;其次在實驗時適當增加對照品的取樣量、稀釋過程盡可能選用體積相對較大的量具并盡可能減少稀釋步驟,增加平行樣測定,也可以適當減少不確定度分量所占的比重。