氫化物-原子吸收光譜法測定人凝血酶原復合物中銻的含量

吳勰乾,韓 楊,霍建富,連建科,任 飛

(1 山西康寶生物制品股份有限公司技術中心,長治 046000;2 長治醫學院中心實驗室;*通訊作者,E-mail:renfei@czmc.edu.cn)

人凝血酶原復合物(human prothrombin complex)系由健康人血漿經低溫乙醇蛋白分離法或經批準的其他分離法分離純化,并經病毒去除和滅活處理、凍干制成[1]。臨床上廣泛應用于治療乙型血友病、FⅡ、FⅦ及FⅩ先天性缺乏、產生FⅧ抑制物的甲型血友病和因肝疾患引起的凝血功能異常以及由維生素K缺乏而繼發的Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子低下所致的出血癥[2,3]。

人凝血酶原復合物使用的藥包材為中性硼硅玻璃模制注射劑瓶和注射用冷凍干燥用鹵化丁基橡膠塞,注射劑瓶中常加入三氧化二銻作為澄清劑[4],對人體具有慢性毒性與致癌性[5]。為保證藥品質量,我們針對人凝血酶原復合物進行了銻含量的研究。

根據《藥用玻璃鉛、鎘、砷、銻浸出量限度》[6]和《砷、銻、鉛、鎘浸出量測定法》[7]可知YBB標準中銻含量的常用測定方法為孔雀石綠-分光光度法,但該法測定前處理操作繁瑣,所用試劑如甲苯、孔雀綠均對人體毒性較大,方法靈敏度低。因此我們購置了銻陰極燈,并參考文獻[4]和《中國藥典》2015年版四部通則2321“鉛、鎘、砷、汞、銅測定法”[8]中砷含量的測定方法,建立了更簡單、快速、靈敏度高、對人體毒性小的氫化物-原子吸收光譜法測定人凝血酶原復合物中銻含量的測定方法,進行了方法學研究。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

人凝血酶原復合物(山西康寶生物制品股份有限公司,批號:20170905-1、20170905-2、20170905-3);銻單元素溶液標準物質(以下簡稱銻標準溶液,含量:100 μg/ml,中國計量科學研究院,批號:GBW(E)080545-16094);硝酸(優級純,上海阿拉丁公司,批號:H160105);硼氫化鈉(分析純,山東西亞化學股份有限公司,批號:Q9812);氫氧化鈉(分析純,天津市富起化工有限公司,批號:160418);濃鹽酸(藥用級,成都華邑藥用輔料制造有限公司,批號:20170404);碘化鉀(分析純,國藥集團化學試劑有限公司,批號:20121128);抗壞血酸(分析純,上海阿拉丁公司,批號:1325051);注射用水(山西康寶生物制品股份有限公司)。

1.2 儀器

AA-6300C型原子吸收分光光度計(日本島津公司);WHG-630A型流動注射氫化物發生器(北京浩天暉科貿有限公司);銻空心陰極燈(日本島津公司);MD20H型微波消解儀(奧普樂儀器有限公司);加熱板(北京中興偉業儀器有限公司);HH-4型水浴鍋(常州市金壇科興儀器廠)。

實驗中所有使用到的玻璃器皿均需浸泡在10% HNO3溶液中24 h以上,使用前先用自來水沖洗干凈,再用注射用水沖洗干凈。

2 方法與結果

2.1 測定條件

采用流動注射氫化物發生器,以含1%硼氫化鈉和0.3%氫氧化鈉溶液(臨用前配制)作為還原劑,鹽酸溶液(1→100)為載液,氮氣為載氣,檢測波長為217.6 nm,光源燈電流13 mA,狹縫0.7 nm。

2.2 試液配制

2.2.1 銻標準貯備液的制備 精密量取銻標準溶液適量,用2%硝酸溶液稀釋,制成每1 ml含銻100 ng的溶液。

2.2.2 2%硝酸溶液 量取硝酸適量,用水稀釋制成2%的溶液。

2.2.3 含1%硼氫化鈉和0.3%氫氧化鈉溶液 稱取氫氧化鈉0.3 g,硼氫化鈉1.0 g,用水溶解后,加水至100 ml,搖勻(臨用前配制)。

2.2.4 鹽酸溶液(1→100) 量取濃鹽酸1 ml,用水稀釋至100 ml。

2.2.5 25%碘化鉀溶液 稱取碘化鉀25 g,用水溶解后,加水至100 ml,搖勻(臨用前配制)。

2.2.6 10%抗壞血酸溶液 稱取抗壞血酸10 g,用水溶解后,加水至100 ml,搖勻(臨用前配制)。

2.2.7 鹽酸溶液(20→100) 量取濃鹽酸20 ml,用水稀釋至100 ml。

2.3 測定方法

標準曲線的標定:每次測定前需先進行標準曲線的標定,操作方法詳見2.4.1。

供試品溶液的制備:取供試品,加10 ml注射用水,輕輕搖動至完全溶解。精密量取5 ml置消解罐內,加濃硝酸5 ml,在設定好的消解程序(第一步5 min升溫至120 ℃保持3 min,第二步5 min由120 ℃升溫至150 ℃保持3 min,第三步由150 ℃升溫至180 ℃保持15 min)中進行微波消解。消解完全后置電熱板上緩緩加熱至紅棕色蒸汽揮盡,放冷,轉入10 ml量瓶中,用少量2%硝酸洗滌消解罐,洗液一并入量瓶中,用2%硝酸定容至刻度,搖勻。精密量取10 ml,置25 ml量瓶中,加25%碘化鉀溶液(臨用前配制)1 ml,搖勻,加10%抗壞血酸溶液(臨用前配制)1 ml,搖勻,用鹽酸溶液(20→100)稀釋至刻度,搖勻,密塞,置80 ℃水浴中加熱3 min,取出,放冷,作為供試品溶液,同法同時制備供試品空白溶液。

測定法:取適量,吸入流動注射氫化物發生器,測定吸光度。將供試品吸光度代入標準曲線方程計算供試品溶液中銻的含量。

2.4 方法學研究

2.4.1 線性關系與范圍的考察 分別精密量取銻標準貯備液適量,用2%硝酸溶液稀釋制成每1 ml分別含銻0,5.0,10.0,15.0,20.0,25.0 ng的溶液,再精密吸取10 ml,置25 ml量瓶中,加25%碘化鉀溶液(臨用前配制)1 ml,搖勻,加10%抗壞血酸溶液(臨用前配制)1 ml,搖勻,用鹽酸溶液(20→100)稀釋至刻度,搖勻,密塞,置80 ℃水浴中加熱3 min,取出,放冷,同法同時制備對照品空白溶液。取適量,吸入流動注射氫化物發生器,測定吸光度。以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標,回歸計算。回歸方程:y=0.008 3x+0.008 5,r=0.997 1。式中:y為吸光度值;x為銻濃度,單位為ng/ml。銻濃度對吸光度的線性關系結果見表1。結果表明:銻含量在0-25.0 ng/ml范圍內線性關系良好。

表1 線性關系試驗結果Table 1 Results of the linear relationship

2.4.2 檢出限和定量限的測定 取試劑空白溶液(2%硝酸溶液)連續測量11次,記錄吸光度值,求出標準差,結果見表2。

表2 試劑空白溶液吸光度值 (n=11)Table 2 Absorbance of the blank solution (n=11)

按2.4.1方法,以每1 ml分別含銻0,5.0,10.0,15.0,20.0,25.0 ng的對照溶液,測定吸光度,做線性回歸方程,得標準曲線斜率。檢出限=3×空白標準差/標準曲線斜率;定量限=10×空白標準差/標準曲線斜率。結果檢出限為0.553 3 ng/ml;定量限為1.844 ng/ml。

2.4.3 標準溶液重復測定的精密度試驗 取銻標準溶液(10.0 ng/ml),連續進樣6次,記錄吸光度值,計算平均吸光度和RSD值,結果見表3。結果顯示:RSD值為4.36%,說明該方法精密度良好。

2.4.4 加樣回收率試驗 取人凝血酶原復合物(批號:20170905-1),加10 ml注射用水,輕輕搖動至完全溶解。精密量取5 ml置消解罐內,加濃硝酸5 ml,在設定好的消解程序(第一步5 min升溫至120 ℃保持3 min,第二步5 min由120 ℃升溫至150 ℃保持3 min,第三步由150 ℃升溫至180 ℃保持15 min)中進行微波消解。消解完全后置電熱板上緩緩加熱至紅棕色蒸汽揮盡,放冷,轉入10 ml量瓶中,用少量2%硝酸洗滌消解罐,洗液一并入量瓶中,用2%硝酸定容,搖勻。

回收率樣品溶液制備:精密量取供試品消解后溶液5 ml,置25 ml量瓶中,共9份樣品,分別加入銻標準貯備液(100 ng/ml)1.0,1.5,2.0 ml,再各加入2%硝酸溶液4.0,3.5,3.0 ml,制成低、中、高濃度的回收率樣品溶液各3份。各樣品再加25%碘化鉀溶液(臨用前配制)1 ml,搖勻,加10%抗壞血酸溶液(臨用前配制)1 ml,搖勻,用鹽酸溶液(20→100)稀釋至刻度,搖勻,密塞,置80 ℃水浴中加熱3 min,取出,放冷,作為回收率樣品溶液。取適量,吸入流動注射氫化物發生器,測定吸光度。將回收率樣品溶液吸光度代入標準曲線方程計算出銻的含量,計算回收率,結果見表4。

表4 加樣回收率試驗結果 (n=9)Table 4 Results of sample recovery test (n=9)

經檢測,供試品溶液吸光度為負值,所以銻含量為未檢出。若供試品銻含量按0計,則平均回收率105.24%,RSD為7.71%。回收率在95.93%-118.62%之間,結果良好。

2.4.5 樣品檢測 分別取3批人凝血酶原復合物(批號:20170905-1,20170905-2,20170905-3)樣品,按銻含量測定法檢測,結果顯示:3批樣品溶液吸光度均為負值,未檢出銻含量(見表5)。

表5 3批人凝血酶原復合物樣品檢測結果Table 5 Determination results in 3 batches of samples

3 討論

硼氫化鈉是一種強還原劑,其濃度在氫化物反應中對吸光度影響顯著。硼氫化鈉濃度過低時還原能力弱影響氫化物的生成效率;硼氫化鈉濃度過高時會產生過多氫氣稀釋亞氫焰使靈敏度下降。經考察,含1%硼氫化鈉和0.3%氫氧化鈉溶液作為還原體系時多余氫氣產生較少。

此外,對比《氫化物發生-原子吸收法測定藥用玻璃容器中砷和銻的浸出量》[4],使用微波消解大大提高了反應速率,縮短了樣品制備時間,證明消解程序設置合理、有效。

綜上,通過對銻含量氫化物-原子吸收光譜測定法方法學研究,結果表明:該方法精密度好、回收率符合要求。與傳統方法相比較,具有操作簡單、快速、靈敏度高等優點,更適合作為人凝血酶原復合物中銻含量的測定方法。