張可可，崔正國，李悅悅，曲克明

(1 上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室，山東省漁業資源與生態環境重點實驗室，中國水產科學研究院黃海水產研究所，青島海洋科學與技術試點國家實驗室，海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266071)

采用復合垂直流人工濕地系統，在探討海水養殖尾水中氮去除效果的基礎上，利用一級動力學模型，擬合了不同形態無機氮、有機氮的動力學降解特征，并分析了海水人工濕地氮凈化效果與微生物群落組成、pH、溶氧、溫度等因素間的關系，以期為系統闡明海水人工濕地的除氮機理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

復合垂直流人工濕地具有下行流和上行流的復合水流方式，可實現較長的水力停留時間(HRT)，使其硝化、反硝化能力顯著強于其他類型濕地。構建了實驗室規模的復合垂直流人工濕地水處理循環系統，循環系統包括人工濕地處理系統和養殖水回用系統兩大部分。人工濕地規格為60 cm × 40 cm × 70 cm，有效體積為60 L，由上、下行池構成，進水口處安裝布水管，以確保養殖尾水均勻進入處理系統(圖1)。

下行池、上行池基質的填充材料按照粒徑由大到小、自下而上分別為：粒徑3～5 cm的粗珊瑚石各20 cm，粒徑1～3 cm的細珊瑚石各20 cm，粒徑1～2 mm的細砂20 cm、15 cm。濕地植物選取耐鹽堿且根系發達的互花米草，種植密度為32株/m2。試驗用水為牙鲆海水養殖尾水。

1.2 試驗內容及方法

1.2.1 運行與采樣方法

人工濕地循環水處理系統釆用序批式進水方式，水力停留時間約為9 min。將牙鲆養殖尾水通過水泵和布水管均勻注入人工濕地處理系統下行池，養殖尾水自下行池底部流入上行池，經人工濕地處理系統后進入儲水池，然后通過水泵再循環至濕地系統。正式試驗前先進行預試驗。其中無植物人工濕地處理系統運行1個月，然后篩選生長狀況良好的植株移植到系統中再運行1個月。經過2個月的試運行，微生物群落形成，出水水質基本達到穩定。每天監測系統進出水指標，2周后處理系統達到穩定狀態。

溫度、溶氧(DO)、pH等理化參數及主要水質指標每2 d監測一次，水樣過濾后置于-20 ℃冰箱內冷凍儲存，用于測定DIN、DON和TDN的質量濃度。完成氮降解動力學試驗后，進行微生物樣品采集。利用五點取樣法(圖2)分別采集不同基質層和植物根部樣品進行16S rDNA測序。采樣后，將各層基質和植物根部樣品分別混勻，基質層樣品分別記為S1、S2、S3、S4、S5、S6，上行池和下行池植物根部分別記為G1和G2，共8個樣品分別放入無菌袋后置于-80 ℃冰箱保存。

圖2 復合垂直流人工濕地循環系統采樣示意圖

1.2.2 水質分析

1.2.3 微生物群落結構PCR-DGGE分析

以樣品基因組DNA為模板，采用細菌引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)擴增樣品16S rDNA高變區序列，其中，PCR儀為ABI GeneAmp? 9700型。

PCR擴增體系(20 μL)：5×FastPfu Buffer 4 μL；dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL；rTaq(5 U/μl)0.4 μL；Forward Primer(5 umol/L)0.8 μL；Reverse Primer(5 umol/L)0.8 μL；FastPfu Polymerase 0.4 μL；BSA 0.2 μL；Template DNA 10 ng；補ddH2O至20 μL。

PCR擴增程序：第1階段，95 ℃ 預變性3 min；第2階段，95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s和72 ℃延伸45 s，循環27次；第3階段，72 ℃延伸7 min，后10 ℃保存。

1.3 結果與數據分析

采用一級動力學模型描述人工濕地中各形態氮的降解過程，計算公式如下[7]：

(1)

式中：c表示出水質量濃度，mg/L；c0表示進水質量濃度，mg/L；c*表示背景質量濃度，mg/L；T表示尾水凈化時間，h；Kv表示去除速率常數，h-1。

半衰期計算公式為：

T1/2=ln2/Kv

(2)

式中：T1/2表示半衰期，h；Kv表示去除速率常數，h-1。

微生物多樣性用Shannon指數表征[12]，其值越大說明群落多樣性越高。試驗數據采用Origin 2018和Excel 2016處理。

2 結果

2.1 人工濕地系統內各形態氮的去除效果

2.1.1 DIN、DON和TDN的去除效果

試驗期間，系統內水質pH(7.34±0.37)，DO(7.00±0.33)mg/L，水溫(16.32±0.32)℃，鹽度(32.79±1.37)，各理化參數有利于系統內脫氮過程的進行。人工濕地系統出水口處TDN、DON、DIN質量濃度和去除率如圖3a所示。從圖中可以看出，3種氮出水質量濃度均呈下降趨勢，DIN的質量濃度降低明顯，第5天質量濃度為0.49 mg/L，出水質量濃度符合SC/T 9103—2007《海水養殖水排放要求》一級標準[13](≤0.50 mg/L)，去除率為90.70%；TDN去除效果次之，去除率為72.65%；DON去除效果較差，去除率僅為44.53%。

DIN、DON占TDN質量濃度比例如圖3b所示。DIN質量濃度占比總體呈下降趨勢，第0天為60.13%，5 d后基本穩定在20%左右；DON質量濃度占比隨系統運行呈升高趨勢，第5天達到79.76%。因而，DON較DIN難降解。

圖3 人工濕地系統DIN、DON、TDN去除效果和比例變化

圖4 人工濕地系統去除效果和比例變化

2.2 不同形態氮降解的動力學特征

2.2.1 DIN、DON和TDN降解特征

人工濕地處理牙鲆養殖尾水過程中，DIN、DON、TDN的動力學擬合曲線及參數如圖5a、表1所示。一級動力學模型能夠較好地描述人工濕地系統中DIN、DON、TDN的降解特征，其中，DIN、TDN的擬合程度最好，擬合度R2分別為0.98和0.99，DON稍差，R2為0.70。3種氮的去除速率常數和半衰期有所不同，DIN去除速率最快，去除速率常數和半衰期分別為0.10 h-1和7.24 h；TDN次之，分別為0.09 h-1和7.47h；DON最難降解，分別為0.03 h-1和27.18 h。

圖5 人工濕地系統內DIN、DON、TDN和的降解擬合曲線

表1 氮的動力學參數

2.3 微生物多樣性分析

2.3.1 16S rDNA PCR擴增結果

從圖6可以看出，經PCR擴增后的8個樣品DNA均只含一條亮帶，未出現非特異性擴增，且陰性對照未有產物出現，表明PCR擴增效果良好，可用于DGGE分析。

圖6 PCR擴增結果鑒定電泳圖

2.3.2 微生物群落多樣性

不同基質層和植物根部樣品的微生物群落Shannon指數見圖7。人工濕地系統中不同基質層間微生物群落的Shannon指數均在6以上，表明植物根部和基質層間的微生物多樣性都較高。系統中上、下行池兩組取樣點微生物群落的Shannon指數差異不顯著(P>0.05)，系統中植物根部微生物群落Shannon指數略低于基質層。

圖7 各樣品的微生物群落Shannon指數

2.3.3 微生物群落組成

復合垂直流人工濕地系統在門水平上的微生物群落結構如圖8所示。人工濕地系統中基質及植物根部微生物豐富度很高，這與系統具有較好的凈化效果符合。將豐度>1%的菌門作為主要菌門，共發現11個菌門，分別為變形菌門(Proteobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、匿桿菌門(Latescibacteria)、厚壁菌門(Firmocutes)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)。其中，基質和植物根部主要的優勢菌門為變形菌門(31.52%～37.87%)、藍細菌門(8.34%～19.81%)、放線菌門(8.30%～14.07%)、綠彎菌門(8.72%～ 13.81%)和擬桿菌門(5.66%～10.46%)。

圖8 人工濕地系統內微生物群落組成圖

3 討論

3.1 微生物群落對氮降解的影響分析

需要說明的是，本試驗獲得的動力學參數只是在小試人工濕地系統中的模擬結果，在實際生產應用中，還需進行更大規模的中試試驗和現場試驗的驗證，以便使試驗結果更加貼近實際應用。

3.2 其他因素對氮降解的影響

4 結論

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