非小細胞肺癌組織miR-25表達變化及其臨床意義

秦維超，張琳

1 重慶市江津區中心醫院，重慶402260；2 成都中醫藥大學附屬醫院

肺癌是世界范圍內威脅人類健康的常見惡性腫瘤，根據病理類型可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC占80%～85%[1]。在臨床上，大多數NSCLC患者就診時已處于中晚期，錯過了最佳治療時機，5年生存率往往不足15%[2]。因此，早發現、早治療成為延長NSCLC患者生存期的關鍵。但是迄今為止，還沒發現可靠的生物標志物早期預測NSCLC的發生、發展。微小RNA(miRNA)是一類內源性非編碼單鏈小分子RNA，長度約為22個核苷酸，能夠通過與靶基因3′非編碼區特異性結合使靶基因降解或翻譯抑制，從而在轉錄后水平調節基因的表達[3，4]。近年研究發現，miRNA在腫瘤的發生、發展過程中具有重要作用。miR-25是近年發現的腫瘤相關miRNA之一，屬于miR-106b-25家族，定位于人7號染色體，可在多種腫瘤組織中表達上調，在腫瘤的發生、發展過程中具有重要的調控作用[5]。已有研究證實，miR-25能夠參與肺癌的發生、發展，有可能成為肺癌早期診斷的分子生物標志物和潛在的藥物治療靶點[6]。但鮮見miR-25表達與NSCLC患者遠期生存率關系的報道。本研究觀察了NSCLC組織miR-25表達變化，并進一步分析其表達與患者臨床病理特征和預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年5月～2014年5月重慶市江津區中心醫院收治的NSCLC患者68例。所有患者經術后組織病理學檢查明確診斷。納入標準：①符合NSCLC診斷標準；②接受肺葉或全肺切除術、肺段或肺楔形切除術+系統性淋巴結清掃術，切緣均陰性；③術前未接受任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料和術后隨訪資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并心、肝、腎等重要臟器嚴重功能障礙者；③合并哮喘、慢性阻塞性肺疾病等其他肺部疾病者。其中，男42例、女26例，年齡(54.2±15.7)歲(<50歲29例、≥50歲39例)；吸煙指數：<400年支26例，≥400年支42例；腫瘤直徑：<3 cm 29例，≥3 cm 39例；病理類型：鱗癌43例，腺癌25例；TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期26例，Ⅲ期20例；病理分級：G1級28例，G2級30例，G3級10例；有淋巴結轉移28例，無淋巴結轉移40例。本研究經重慶市江津區中心醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 miR-25表達檢測 采用RT-qPCR法。取手術切除的NSCLC組織及其配對的癌旁組織(距腫瘤組織邊緣>5 cm，且經組織病理學檢查證實為正常肺組織)，液氮速凍后，轉運至-80 ℃冰箱保存，待組織成批。實驗前取NSCLC組織和癌旁正常組織各約30 g，液氮下研磨成粉，采用TRIzol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續實驗。按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明將總RNA反轉錄為cDNA。反轉錄條件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 10 min。以cDNA為模板，按照SYBRGreen Realtime PCR Master Mix說明進行PCR擴增。所有引物序列由北京華大基因研究中心有限公司設計合成。miR-25上游引物5′-AGAACGCATTGCCACATACA-3′，下游引物5′-TGCTTAACCCCTCACCTTGA-3′；β-actin上游引物5′-CGCGAGAAGATGACCCAGATC-3′，下游引物5′-TGGTACGGCCAGAGGCG-3′。PCR反應體系共20 μL：2×PCR buffer 2 μL，Taq DNA聚合酶1 U，dNTPs 0.3 mmol/L，上下游引物各0.8 μmol/L，模板DNA 40 ng，用ddH2O補足至20 μL；反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、54 ℃ 1 min、72 ℃ 1.5 min共35個循環，最后72 ℃ 10 min。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-25相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者術后定期門診復查，術后2年內每3～6個月復查1次，術后2～5年每6個月復查1次，術后5年以上每年復查1次。隨訪截至2019年5月，統計患者生存情況。

2 結果

2.1 NSCLC組織與癌旁正常組織miR-25表達比較 NSCLC組織miR-25相對表達量為1.22±0.16，癌旁正常組織為0.48±0.08。NSCLC組織miR-25相對表達量高于癌旁正常組織(t=7.27，P<0.01)。

2.2 NSCLC組織miR-25表達與患者臨床病理特征的關系 以NSCLC組織miR-25相對表達量的均數為臨界值，將患者分為miR-25高表達者31例、miR-25低表達者37例。NSCLC組織miR-25表達與患者臨床病理特征的關系見表1。

表1 NSCLC組織miR-25表達與患者臨床病理特征的關系[例(%)]

2.3 不同miR-25表達者5年生存率比較 隨訪截至2019年5月，miR-25高表達者失訪4例、死亡14例，5年生存率為51.6%；miR-25低表達者失訪8例、死亡8例，5年生存率為78.4%。miR-25高表達者5年生存率低于miR-25低表達者(χ2=4.968，P<0.05)。見圖1。

圖1 不同miR-25表達者的生存曲線

2.4 影響NSCLC患者預后的危險因素分析 以NSCLC患者性別、年齡、吸煙指數、腫瘤直徑、病理類型、TNM分期、病理分級、淋巴結轉移和miR-25表達為自變量，隨訪截至日期患者生存狀況為因變量，進行單因素Cox回歸模型分析。結果顯示，吸煙指數、病理類型、TNM分期、病理分級、淋巴結轉移和miR-25表達可能與NSCLC患者預后有關(P均<0.05)，而性別、年齡、腫瘤直徑與NSCLC患者預后無關(P均>0.05)。多因素Cox回歸模型分析顯示，吸煙指數、TNM分期、病理分級、淋巴結轉移和miR-25表達是影響NSCLC患者預后的獨立危險因素(P均<0.05)。見表2、3。

表2 影響NSCLC患者預后的單因素Cox回歸模型分析結果

表3 影響NSCLC患者預后的多因素Cox回歸模型分析結果

3 討論

近年來，隨著環境污染加重、人口老齡化加劇，我國男性肺癌的發病率高居所有惡性腫瘤首位，女性肺癌的發病率僅次于乳腺癌，居第2位[7，8]。根據病理類型，可將肺癌分為小細胞肺癌和NSCLC，其中NSCLC占80%～85%[1]。大多數NSCLC患者就診時已處于中晚期，錯過了最佳治療時機，5年生存率往往不足15%[2]。因此，早發現、早治療成為延長NSCLC患者生存期的關鍵。目前，臨床常用的肺癌診斷方法有痰脫落細胞學檢查、支氣管鏡檢查、肺泡灌洗液檢查、經皮穿刺肺活檢等。但這些檢查并不適合作為肺癌大規模的篩查手段。腫瘤標志物是反映體內腫瘤存在的一種化學類物質，廣泛用于腫瘤的篩查、診斷和治療。但迄今為止尚未發現可靠的生物標志物早期預測NSCLC的發生、發展。

miRNA在細胞生長、發育過程中發揮關鍵的調控作用[9]。近年越來越多研究發現，miRNA在多種惡性腫瘤中異常表達，可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發生、發展[10]。miRNA在外周血、組織、痰液、胸腔積液、肺泡灌洗液中均穩定表達且不易被降解，具有作為腫瘤標志物的潛能。miR-25是近年發現的腫瘤相關miRNA之一，屬于miR-106b-25家族，定位于人7號染色體。有研究發現，miR-25能夠促進視網膜母細胞瘤的惡性表型[11]；下調miR-25表達，能夠抑制卵巢癌細胞生長和遷移[12]；miR-25能夠通過靶向調控FBXW7、DKK3表達，促進膠質瘤細胞增殖和遷移[13]。有研究還發現，胃癌患者血清miR-25水平升高，血清miR-25可作為胃癌早期診斷和預后評估的生物標志物[14]。以上研究表明，miR-25能夠參與多種惡性腫瘤的發生、發展。有研究發現，NSCLC患者血清miR-25水平明顯升高，其水平越高，腫瘤惡性程度越高，患者預后越差[15]。但目前二者的關系缺乏大規模的臨床研究。

本研究結果發現，NSCLC組織miR-25相對表達量高于癌旁正常組織，提示miR-25在NSCLC的發生、發展過程中可能發揮促癌基因作用。為進一步研究miR-25表達與NSCLC患者臨床病理特征和預后的關系，以NSCLC組織miR-25相對表達量的均數為臨界值，將NSCLC患者分為miR-25高表達者與低表達者。結果發現，miR-25高表達者吸煙指數、TNM分期和病理分級較高，淋巴結轉移較多，進一步證實miR-25能夠參與NSCLC的惡性進展。本研究miR-25高表達者5年生存率明顯低于miR-25低表達者，提示miR-25表達與NSCLC患者預后有關，與以往報道[16，17]基本一致。本研究Cox回歸模型分析顯示，吸煙指數、TNM分期、病理分級、淋巴結轉移和miR-25表達是影響NSCLC患者預后的獨立危險因素。因此，miR-25能夠作為判斷NSCLC患者預后的血清生物學指標。

綜上所述，NSCLC組織miR-25高表達，其高表達與腫瘤的發生、發展有關，并且其高表達是NSCLC患者預后不良的獨立危險因素。