脾臟調節性樹突狀細胞腹腔回輸對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠視神經的保護作用及其機制

侯艷麗，杜然，劉慶陽，王艷玲

1 首都醫科大學附屬北京友誼醫院，北京100050;2 應急總醫院

視神經炎是指發生于視神經的炎癥性疾病，也是一種常見的致盲性眼病，常常會引起急性或亞急性視力喪失。視神經炎按病因可分為特發性視神經炎、感染性或感染相關性視神經炎、自身免疫性視神經病和其他無法歸類的視神經炎4類，在特發性視神經炎中以多發性硬化相關性視神經炎(MSON)最為典型。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是一種CD4+T細胞介導的自身免疫性疾病，因其發生于動物中樞神經系統內，在臨床表現、病理特征及免疫學特性等方面與人類多發性硬化(MS)極為相似，是研究MS的經典動物模型[1，2]。Horstmann等[3]研究發現，EAE模型動物視神經可出現炎癥細胞浸潤、髓鞘脫失、軸突損害及神經節細胞凋亡等病理改變。因此，EAE也是研究MSON的理想動物模型。樹突狀細胞(DC)是MS發病過程中極其重要的專職抗原提呈細胞。CD11c-CD45RBhighDC是新發現的，以CD11c-、CD45RBhigh為特征的DC亞群，通過負向調控維持機體免疫平衡[4]。我們前期研究發現，CD11c-CD45RBhighDC的免疫耐受作用具有轉移性，小鼠腹膜注射CD11c-CD45RBhighDC能夠抑制熱損傷導致的炎癥細胞浸潤，進而減少炎癥細胞因子產生[5，6]。由此推測，CD11c-CD45RBhighDC有可能通過減少促炎癥細胞因子分泌，減輕MSON的炎癥細胞浸潤，從而緩解視神經脫髓鞘損傷。2018年10月～2019年6月，本研究觀察了CD11c-CD45RBhighDC腹腔回輸對EAE小鼠視神經的保護作用，并探討其可能的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性C57BL/6小鼠100只，SPF級，6～8周齡，體質量19～21 g，購自中國醫學科學院北京實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(京)2007-0001。髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55(MOG35-55)，純度≥98%，購自上海強耀生物科技有限公司。MiniMACS磁化細胞分選儀，購自德國Mihenyi Biotec公司。流式細胞儀、陰選試劑盒，購自美國BD公司。完全弗氏佐劑(CFA)、百日咳毒素，購自美國Sigma公司。

1.2 脾臟CD11c-CD45RBhighDC分離、培養與鑒定 隨機選擇C57BL/6小鼠50只，無菌條件下摘取脾臟，置于預先加入足夠膠原酶D溶液的6 cm培養皿中，用1 mL注射器將膠原酶D溶液注入脾臟，使脾臟充分充盈，然后將脾臟剪碎，37 ℃孵育30 min，充分研磨后制成細胞懸液。在離心管中依次加入小鼠淋巴細胞分離液、細胞懸液，離心15 min，吸取中層絮狀物，加入4倍緩沖液重懸，離心去除多余淋巴細胞分離液，所得細胞即為單個核細胞。按陰選試劑盒說明分選獲得DC，經抗CD45RB磁珠陽選獲得CD45RBhighDC，剪切掉細胞上的磁珠，再加入抗小鼠CD11c磁珠，MS磁性分離柱陰選部分即本實驗所需要的CD11c-CD45RBhighDC。將CD11c-CD45RBhighDC置于含10% FBS的RPMI 1640培養液培養約2 h，緩沖液洗滌，1 200 r/min離心7 min，棄上清，留取沉淀。取部分沉淀，分別加入標染的抗CD11c單克隆抗體-別藻藍蛋白和抗CD45RB單克隆抗體-藻紅蛋白染色。染色滿意后，上流式細胞儀鑒定。

1.3 動物分組處理 將剩余C57BL/6小鼠適應性飼養7 d，隨機分為對照組、模型組及低、中、高劑量組，每組10只。對照組常規飼養，不建模；模型組及低、中、高劑量組于背部皮下注射0.2 mL油包水抗原乳劑(2 mg/mL MOG35-55與CFA等體積混合)，第2、3天分別腹腔注射0.2 mL百日咳毒素，制備EAE模型。低、中、高劑量組皮下注射當日分別腹腔回輸CD11c-CD45RBhighDC 1×105、5×105、10×105個/只，對照組與模型組同期腹腔注射等量PBS。

1.4 神經功能觀察 模型組及低、中、高劑量組建模當日開始，每日由兩名研究員采用盲法觀察小鼠神經功能，按照Kono等[7]方法進行神經癥狀評分，連續觀察15 d。對照組同期按相同方法評價神經功能。神經癥狀評分標準：無任何臨床表現，計0分；精神萎靡，尾部無力，計1分；行走步態異常，雙后肢無力，計2分；雙后肢癱瘓，計3分；雙后肢癱瘓伴一側或雙側前肢癱瘓，計4分；瀕死或死亡，計5分。

1.5 血漿IL-6、TNF-α、IL-4和CD4+T細胞計數檢測 模型組及低、中、高劑量組建模第1～3、7、15天，對照組同期，取尾靜脈血0.2 mL，肝素抗凝，4 ℃、1 200 r/min離心10 min，留取上層血漿，-70 ℃保存。采用ELISA法檢測血漿IL-6、TNF-α、IL-4，采用流式細胞儀計數CD4+T細胞。所有操作嚴格按試劑盒說明或儀器規定流程進行。

1.6 視神經組織病理學觀察 模型組及低、中、高劑量組建模第15天，對照組同期，尾靜脈采血后用2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后開胸，剪開左心耳，經左心室/升主動脈依次灌注生理鹽水5 mL、預冷的4%多聚甲醛50 mL。自篩板后0.5 mm處取球后視神經組織，常規固定、脫水、透明后石蠟包埋，4 μm厚切片。切片烤片后，脫蠟至水，分別行HE染色、LFB染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光鏡下觀察視神經組織病理變化。

2 結果

2.1 CD11c-CD45RBhighDC分離與鑒定 通過磁珠分選儀獲取脾臟CD11c-CD45RBhighDC，經流式細胞儀檢測，CD11c-CD45RBhighDC純度>85%。

2.2 各組神經功能觀察 連續觀察15 d，對照組未出現明顯神經功能異常，神經癥狀評分均為0分。模型組及低、中、高劑量組建模第1～9天均未出現明顯神經功能異常，神經癥狀評分均為0分；建模第10天，模型組及低、中、高劑量組開始出現神經功能異常，神經癥狀評分的中位數分別為2、1、1、1分；建模第15天，模型組及低、中、高劑量組神經癥狀評分的中位數分別為3、1、1、1分。模型組建模第10、15天神經癥狀評分均高于低、中、高劑量組(P均<0.05)，而低、中、高劑量組兩兩比較P均>0.05。

2.3 各組不同時間血漿IL-6、TNF-α、IL-4水平和CD4+T細胞計數比較 見表1。

表1 各組不同時間血漿IL-6、TNF-α、IL-4水平和CD4+ T細胞計數比較

2.4 各組視神經組織病理變化 建模第15天，HE染色光鏡下可見，對照組視神經橫切面呈類圓形，視神經染色均勻，纖維排列整齊、致密，其間有散在的神經膠質細胞，無任何炎癥細胞浸潤表現；模型組視神經纖維出現曲折或波浪狀，排列混亂，部分軸突變性，光軸束網狀分層，形成大量液泡；低、中、高劑量組較模型組視神經炎癥細胞浸潤明顯減輕，軸索空泡樣變性明顯減少，尤其以高劑量組最為明顯。LFB染色光鏡下可見，對照組視神經髓鞘完整，無液泡變性；模型組視神經出現廣泛脫髓鞘和液泡變性；低、中、高劑量組較模型組視神經脫髓鞘和液泡變性明顯減輕，尤其以高劑量組最為明顯。

3 討論

MSON是一種自身免疫性疾病，其病因和發病機制至今尚不完全清楚。目前，在臨床上普遍采用激素沖擊和免疫抑制劑治療MSON，雖然能夠快速提高視覺質量，但因缺乏針對性，不能逆轉預后，并且停藥后復發率較高[8，9]。國內外一些學者嘗試生物制劑，如免疫球蛋白，其治療MSON的效果亦不理想。脾臟CD11c-CD45RBhighDC是一種調節性DC，在體內不僅可以控制免疫反應，還能維持周圍免疫環境的穩定性[10]。2006年Sato等嘗試了經腹腔或靜脈注射CD11c-CD45RBhighDC來干預膿毒癥小鼠預后，結果顯示膿毒癥病情迅速被控制，小鼠死亡率明顯降低，這為CD11c-CD45RBhighDC體內回輸治療相關疾病奠定了基礎。

EAE是目前研究MSON的理想動物模型。EAE是一種由MOG35-55誘發的，類似于人類MS的炎癥性脫髓鞘疾病，其視神經脫髓鞘改變與MSON相似。有研究認為，EAE小鼠視神經脫髓鞘可能與Th1細胞免疫反應增強、Th2細胞免疫反應減弱導致的Th1/Th2細胞免疫失衡有關[11]。炎癥細胞浸潤神經組織后可誘導促炎癥細胞因子分泌，使周圍自身反應性T細胞活化，通過已破壞的血腦屏障滲透至中樞神經系統和視神經，從而產生自身免疫性損傷[12，13]。因此，脾臟CD11c-CD45RBhighDC腹腔回輸有可能通過減輕炎癥細胞浸潤，從而減輕EAE視神經免疫損傷。

本研究提取C57BL/6小鼠脾臟單個核細胞，通過磁珠分選儀獲取脾臟CD11c-CD45RBhighDC，經流式細胞儀檢測CD11c-CD45RBhighDC純度>85%。本研究結果顯示，連續觀察15 d，對照組未出現明顯神經功能異常，模型組隨著病情進展，開始逐漸出現神經功能異常，而低、中、高劑量組神經功能異常較模型組同期明顯減輕。與對照組比較，模型組血漿IL-6、TNF-α水平和CD4+T細胞計數明顯升高，其視神經組織中可見明顯炎癥細胞浸潤和脫髓鞘、液泡變性等病理改變，提示EAE模型構建成功。進一步研究發現，低、中、高劑量組血漿IL-6、TNF-α水平和CD4+T細胞計數較模型組明顯降低，其視神經組織中炎癥細胞浸潤和脫髓鞘、液泡變性等病理改變較模型組明顯減輕，尤其以高劑量組最為明顯。提示脾臟CD11c-CD45RBhighDC腹腔回輸能夠減輕EAE小鼠視神經免疫損傷，并且其作用效果與劑量有關。CD4+T細胞是EAE發病的效應性細胞，在EAE發病早期活化的CD4+T細胞比例在外周引流淋巴結中開始上調，這種情況一直持續到疾病緩解。本研究脾臟CD11c-CD45RBhighDC腹腔回輸后，EAE小鼠CD4+T細胞異常增多被顯著抑制，回輸的CD11c-CD45RBhighDC數量越多，其抑制作用越明顯。與模型組比較，低、中、高劑量組Th1型免疫反應的代表因子TNF-α明顯下降，而Th2型免疫反應的代表因子IL-4卻在疾病整個過程中無明顯變化，表明低、中、高劑量組體內Th1/Th2出現下調。本研究脾臟CD11c-CD45RBhighDC腹腔回輸能夠明顯改善EAE視神經炎癥細胞浸潤和脫髓鞘改變，其機制可能與以下4個因素有關：①CD11c-CD45RBhighDC表面低表達CD40、CD80和MHC Ⅱ類分子，這些分子的存在使Th1細胞不能被有效激活[14]；②CD11c-CD45RBhighDC能夠通過分泌IL-10，有效控制下游促炎癥細胞因子IL-6、TNF-α的合成和釋放，而且IL-10能夠抑制抗原提呈作用和誘導1型調節性T細胞分化，以正反饋的方式促進IL-10釋放，進一步抑制Th1細胞分泌IL-6、TNF-α[15，16]；③CD11c-CD45RBhighDC通過誘導T細胞失能使免疫反應偏移，誘導調節性T細胞形成并促使活化的T細胞凋亡等負性調控免疫反應；④CD11c-CD45RBhighDC抑制CD4+T細胞增多，減少其向中樞神經系統的滲漏。

綜上所述，脾臟CD11c-CD45RBhighDC腹腔回輸可能通過抑制促炎癥細胞因子分泌，減少CD4+T細胞浸潤，糾正Th1/Th2細胞平衡紊亂，從而減輕EAE小鼠視神經免疫損傷。本研究可能為MSON臨床治療提供了新的思路。