依托考昔對大鼠絕經后骨質疏松性骨折愈合的影響

王一寒，張云輝，李亙，張超，董宇啟

1 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院南院，上海201112；2 上海市寶山區中西醫結合醫院3 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院

骨質疏松癥是一種以骨量減少、骨組織微結構破壞、骨脆性增加和易發生骨折為特征的全身性疾病，是絕經后婦女的常見病、多發病。骨質疏松性骨折是骨質疏松癥最嚴重的后果，能夠使患者日常生活活動和自理能力下降，甚至喪失獨立生活能力[1，2]。據報道，2010年我國發生骨質疏松性骨折患者約233萬例，至2050年，骨質疏松性骨折患者將達到599萬例[3]。因此，骨質疏松性骨折不僅是一個公共健康問題，還是一個重要的社會問題。COX-2抑制劑是骨折圍手術期鎮痛的常用藥物。有研究報道，COX-2抑制劑能夠使骨折愈合延遲[4，5]。但也有研究認為，COX-2抑制劑并不影響骨折愈合[6，7]。依托考昔是一種高選擇性COX-2抑制劑，用于骨科圍手術期具有良好的鎮痛效果[8]，其對骨折愈合影響的研究結論不盡相同[9，10]，但鮮見其對骨質疏松性骨折愈合影響的報道。為此，2014年3月～2015年4月，本研究建立了絕經后骨質疏松性骨折大鼠模型，并觀察了依托考昔對骨質疏松性骨折愈合的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性SD大鼠36只，清潔級，7月齡，體質量200～250 g，購自復旦大學醫學院實驗動物科學部，動物許可證號：SYXK(滬)2014-0029。獨立通風籠具飼養，每籠4只。飼養條件：溫度(25±3)℃，濕度(40±3)%，光照12 h明暗交替，自由攝食、飲水。依托考昔，購自杭州默沙東制藥有限公司。萬能材料力學實驗機，購自日本島津株式會社；熒光倒置顯微鏡，購自日本尼康株式會社。

1.2 絕經后骨質疏松性骨折模型構建 所有SD大鼠適應性喂養1周，進食、飲水自如，活動正常，無脫毛、斷尾、死亡等現象，逐一稱量體質量，3%戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，經腹正中切口行雙側卵巢去勢手術[11]；常規飼養3個月后，再次逐一稱量體質量，3%戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，按文獻[12]方法，于股骨中段做一約2 cm縱行切口，逐層剝離，充分暴露股骨，使用擺動鋸片配合骨刀造成橫行骨折，然后用1.2 mm克氏針順行髓內固定，確定骨折端固定穩定和髖、膝關節活動不受限，關閉切口。

1.3 動物分組與藥物干預 所有大鼠內固定術后適應性喂養1周，進食、飲水自如，無脫毛、斷尾、死亡等現象，將大鼠隨機分為長期用藥組、短期用藥組、對照組，每組12只。依托考昔應用于人骨折圍手術期鎮痛的常用劑量為60 mg/d[13]，將依托考昔(每片60 mg)研磨成粉末，用生理鹽水配制成1.1 mg/mL溶液，根據《藥理實驗方法學》按人和動物體表面積折算的等效劑量，設定給藥劑量。長期用藥組每天依托考昔溶液5.4 mg/kg灌胃1次，連續6周；短期用藥組每天依托考昔溶液5.4 mg/kg灌胃1次，連續灌胃1周后，等容量生理鹽水連續灌胃5周；對照組每天等容量生理鹽水連續灌胃6周。

1.4 組織形態學觀察 內固定術后1、2、4周，各組隨機取3只，斷頸處死，取雙側股骨骨折端骨痂組織，-80 ℃保存。待組織成批后，10%中性甲醛固定48 h，100 g/L EDTA-2Na(pH=7.2)脫鈣，每周更換1次，直至脫鈣滿意。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，縱向石蠟包埋，4 μm厚切片，常規HE染色，中性樹膠封固，熒光倒置顯微鏡下拍照。

1.5 生物力學檢測 內固定術后6周，斷頸處死剩余大鼠，取出雙側股骨，去除克氏針，利用萬能材料力學實驗機，采用三點彎曲法檢測股骨骨折愈合處最大載荷和彈性載荷。

2 結果

2.1 各組股骨骨折端骨痂組織形態學觀察 內固定術后1周，對照組可見豐富的纖維組織且排列整齊，并可見散在軟骨骨痂形成，而短期用藥組和長期用藥組可見大量纖維組織，但密度較低且分布不均勻。內固定術后2周，對照組骨小梁開始形成，軟骨骨痂大量增生；短期用藥組可見骨小梁形成且連續，但密度分布不均勻，軟骨細胞增多；長期用藥組以纖維骨痂為主，可見散在骨小梁，連續性差，軟骨骨痂稀疏。內固定術后4周，對照組可見大量排列整齊的骨小梁，基本完成軟骨骨痂的骨轉化過程；短期用藥組骨小梁表現接近對照組，長期用藥組骨小梁粗細不均且排列紊亂，間隙較寬，可見大量軟骨骨痂。

2.2 各組股骨骨折愈合處最大載荷、彈性載荷比較 長期用藥組有1只體型消瘦、毛發稀疏、活動減弱，對照組有1只左側大腿發生感染腫脹，均剔除實驗，再次造模補充。各組股骨骨折愈合處最大載荷、彈性載荷比較見表1。

表1 各組股骨骨折愈合處最大載荷、彈性載荷比較

3 討論

隨著人口老齡化加劇，我國骨質疏松癥的患病率明顯增加。目前，我國骨質疏松癥患者約有9 000萬，至2050年將達到2億。骨質疏松性骨折是骨質疏松癥最嚴重的后果，患者往往伴隨疼痛、抑郁、活動恐懼等，具有較高的致殘率和致死率[14，15]。骨質疏松性骨折多發生于絕經后婦女，并且骨折愈合時間較長，骨不連風險較高。因此，探索絕經后婦女骨質疏松性骨折的相關治療具有重要意義。

COX-2抑制劑能夠通過選擇性抑制COX-2表達來抑制前列腺素合成，從而達到抗炎、鎮痛等作用，其胃腸道不良反應較傳統非甾體抗炎藥明顯減少，是骨科圍手術期鎮痛的常用藥物[16]。依托考昔是一種高選擇性COX-2抑制劑，2002年首先在英國上市，2008年在中國正式上市。國內最早用依托考昔治療急性痛風性關節炎、滑囊炎等，近年開始用于骨科圍手術期鎮痛治療[8]，具有較好的鎮痛效果且鮮有胃腸道不良反應[17]。Moreschi等[9]研究表明，依托考昔能夠延遲新西蘭雄兔自體顱骨的愈合過程，但對最終移植骨愈合無明顯影響；陳海濤等[10]研究發現，依托考昔能夠抑制新西蘭兔橈骨骨折的愈合過程。但國內外鮮見依托考昔對絕經后骨質疏松性骨折愈合影響的報道。

本研究通過雙側卵巢去勢手術建立大鼠骨質疏松癥模型，該模型能夠模擬絕經后婦女骨質疏松的病理過程，其病理生理特征與人類接近[18]，然后按照Xu等[12]方法制備股骨骨折模型，并觀察依托考昔治療不同時間股骨骨折端骨痂組織形態學變化和骨折愈合處最大載荷、彈性載荷。結果發現，內固定術后1周，對照組可見豐富的纖維組織且排列整齊，并可見散在軟骨骨痂形成，而短期用藥組和長期用藥組可見大量纖維組織，但密度較低且分布不均勻，提示內固定術后1周內依托考昔對纖維組織生成的抑制作用不明顯，對軟骨骨痂生成的抑制作用明顯。內固定術后2周，對照組骨小梁開始形成，軟骨骨痂大量生成；短期用藥組可見骨小梁形成且連續，但密度分布不均勻，軟骨細胞增多；長期用藥組以纖維骨痂為主，可見散在的骨小梁，連續性差，軟骨骨痂稀疏，提示連續應用依托考昔2周能夠明顯抑制骨質疏松性骨折愈合。內固定術后4周，對照組可見大量排列整齊的骨小梁，基本完成軟骨骨痂的骨轉化過程，短期用藥組骨小梁表現接近對照組，長期用藥組骨小梁粗細不均勻且排列紊亂，間隙較寬，可見大量軟骨骨痂，提示連續應用依托考昔4周能夠抑制骨性愈合速度和質量，延長愈合時間，但其抑制骨折愈合的作用是可逆的，早期停藥后骨折愈合可恢復到正常水平。骨生物力學特征是評價骨折愈合程度的重要依據。本研究通過萬能材料力學實驗機，采用三點彎曲法檢測股骨骨折愈合處最大載荷和彈性載荷，結果發現，內固定術后6周，長期用藥組股骨骨折愈合處最大載荷、彈性載荷均低于對照組和短期用藥組，而對照組與短期用藥組比較差異均無統計學意義，提示依托考昔能夠降低骨質疏松性骨折的骨性愈合強度，而早期停藥對骨性愈合強度的影響不大。

綜上所述，長期應用依托考昔能夠延遲和抑制大鼠絕經后骨質疏松性骨折愈合，并能使骨折愈合強度降低，而短期應用對骨折愈合的影響不大。