Homer1基因真核表達重組質粒構建及HT22細胞轉染鑒定

曹敏，張曉敏，王培昌，劉靜

首都醫科大學宣武醫院，北京100053

Homer1基因定位于人染色體5q14.2，其編碼蛋白是一類突觸后支架蛋白，主要由短類型Homer1a和長類型Homer1b/c組成[1]。Homer1a含有一個高度保守的激活/血管擴張刺激磷蛋白同族體1(EVH1)同源結構域，而Homer1b/c不僅含有EVH1同源結構域，C末端還存在卷曲螺旋結構域和兩個亮氨酸拉鏈基序[2]。Homer1a C末端缺乏多聚化序列，不具備長類型Homer1b/c的功能，但能競爭性結合Homer1b/c相關結合蛋白，從而起到負性調節作用[3]。Homer1蛋白主要分布于腦、心肌、骨骼肌等組織[4]，能夠參與突觸形成、神經元信號傳導、調節細胞內外Ca2+水平等[5]。有研究證實，Homer1蛋白在創傷性腦損傷(TBI)、阿爾茨海默病(AD)、抑郁癥等疾病中發揮重要作用[6]。全基因組關聯研究發現，重度抑郁癥患者存在Homer1基因變異[7]；敲除Homer1基因的小鼠可表現出與抑郁癥小鼠相似的行為，這可能與Homer1蛋白與腦內代謝型谷氨酸受體(mGluRs)信號通路有關[8]。在AD小鼠腦組織中發現Homer1a表達下降，同時發現在AD小鼠腦組織中Aβ寡聚體可通過與mGluRs5、Homer1蛋白結合，影響神經元內外Ca2+水平，從而降低神經元興奮性[9]。Homer1a是一種保護性蛋白，TBI發生后其表達迅速升高，并通過調節mGluRs-ERK信號通路，減輕神經元水腫，改善神經系統功能[10]。Homer1蛋白在神經系統疾病中的作用被廣泛研究，但Homer1蛋白在AD中對Aβ清除的影響及其對神經元的保護作用缺乏深入研究。2019年1～8月，本研究構建了Homer1基因真核表達重組質粒，并在HT22細胞中轉染和鑒定，為研究Homer1蛋白對腦內Aβ清除的影響及在AD發病機制中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠海馬神經元細胞系HT22(以下稱HT22細胞)，購自賽百慷(上海)生物技術股份有限公司；大腸桿菌TOP10感受態細胞，購自天根生化科技(北京)有限公司。APP/PS1雙轉基因小鼠，雌雄不限，9月齡，體質量25～35 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。熒光定量PCR儀，購自美國ABI公司。真核表達載體p3×FLAG-CMV-10，由中國科學院生物物理研究所提供；Homer1引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成。限制性內切酶Hind Ⅲ、EcoRⅠ，購自美國NEB公司。5×All-In-One RT Master Mix，購自加拿大ABM公司；難轉染細胞轉染試劑jetOPTIMUS，購自法國Polyplus-transfection公司；DNA聚合酶Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；兔源Flag一抗，購自美國Sigma公司；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 Homer1基因真核表達重組質粒構建與鑒定

1.2.1 Homer1基因真核表達重組質粒構建 取APP/PS1雙轉基因小鼠海馬組織約50 mg，采用TRIzol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續實驗。按5×All-In-One RT Master Mix說明，將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。依據GenBank數據庫中鼠Homer1基因mRNA的序列(NM_001284189.2)，設計巢式PCR引物，并在引物兩端加入酶切位點EcoRⅠ、HindⅢ。第1對引物序列：上游引物5′-CCCAAGCTTATGGGGGAGCAACCTATC-3′，下游引物5′-GGAATTCTTAGCTGCATTCCAGTAGC-3′；第2對引物序列：上游引物5′-CCCAAGCTTATGGGGGAGCAACCTATC-3′，下游引物5′-GGAATTCTTAGCTGCATTCCAGTAGC-3′。按Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase說明，以這兩對引物為cDNA模板進行PCR擴增。PCR擴增體系共50 μL：2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各2 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補足至50 μL；反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共35個循環，最后72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用DNA凝膠回收試劑盒回收，然后用限制性內切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ分別對Homer1基因擴增產物和p3×FLAG-CMV-10載體進行雙酶切。Homer1基因擴增產物于37 ℃酶切2 h，p3×FLAG-CMV-10載體于37 ℃酶切4～6 h。將雙酶切后的目的基因Homer1與p3×FLAG-CMV-10載體按3∶1混合，加入T4 DNA連接酶，室溫連接1 h。將連接產物轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞，37 ℃ 200 r/min搖菌45 min，將轉化后菌液涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養基，37 ℃孵育過夜。

1.2.2 Homer1基因真核表達重組質粒酶切鑒定 從LB固體培養基上挑取4～6個單克隆菌落，分別接種于10 mL含氨芐青霉素的液體LB培養基，37 ℃ 200 r/min搖菌12～14 h，按質粒小提試劑盒說明提取質粒。將提取的質粒收集至離心管中，用限制性內切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ進行雙酶切。酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用凝膠成像系統在紫外燈下觀察DNA條帶，根據DNA條帶大小判斷真核表達重組質粒是否構建成功。

1.2.3 Homer1基因真核表達重組質粒測序 構建成功的Homer1基因真核表達重組質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，并將測序結果與GenBank中Homer1基因的cDNA序列進行比對。

1.3 Homer1基因真核表達重組質粒轉染與鑒定

1.3.1 Homer1基因真核表達重組質粒轉染HT22細胞 取HT22細胞約1×106個，接種于含10% FBS的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱培養。每2天更換1次培養基。當細胞生長融合90%以上時，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞并接種于6孔板，于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱培養。隨機將細胞分為p3×FLAG-CMV-10-Homer1重組質粒組、p3×FLAG-CMV-10空載體組、空白對照組，每組設3個復孔。當細胞生長融合60%～70%時，根據難轉染細胞轉染試劑jetOPTIMUS說明，p3×FLAG-CMV-10-Homer1重組質粒組加入p3×FLAG-CMV-10-Homer1重組質粒2 μg、jetOPTIMUS Buffer 200 μL、jetOPTIMUS reagent 2 μL，p3×FLAG-CMV-10空載體組加入p3×FLAG-CMV-10空載體2 μg、jetOPTIMUS Buffer 200 μL、jetOPTIMUS reagent 2 μL，空白對照組加入jetOPTIMUS Buffer 200 μL、jetOPTIMUS reagent 2 μL，37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱培養。培養5～6 h，棄掉原培養基，加入含10% FBS的DMEM培養基繼續培養48 h。

1.3.2 轉染Homer1基因真核表達重組質粒的HT22細胞鑒定 收集上述轉染后的HT22細胞，RIPA裂解提取細胞總蛋白，經BCA法蛋白定量合格后，加入Loading上樣緩沖液，100 ℃水浴變性。取變性蛋白40 μg，SDS-PAGE(10%分離膠、5%濃縮膠)分離蛋白。電泳結束后，采用濕轉法將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Flag一抗(稀釋比1∶1 000)、GAPDH一抗(稀釋比1∶5 000)，4 ℃孵育過夜。次日，分別加入HRP標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(稀釋比1∶10 000)，室溫孵育1 h，ECL發光，暗室中曝光、顯影。Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 Homer1基因真核表達重組質粒構建結果 含酶切位點的Homer1基因序列經PCR擴增和1%瓊脂糖凝膠電泳分離發現，擴增產物片段大小約為1 064 bp，與目的基因片段大小一致。

2.2 Homer1基因真核表達重組質粒酶切鑒定結果 利用限制性內切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ對重組質粒p3×FLAG-CMV-10-Homer1進行雙酶切，經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統中紫外燈下可見1 064 bp處的Homer1目的片段和6 200 bp處的p3×FLAG-CMV-10載體片段。

2.3 Homer1基因真核表達重組質粒測序結果 將酶切鑒定陽性的Homer1基因真核表達重組質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果與在GenBank中檢索的Homer1基因cDNA序列進行比對，證實Homer1基因中插入了p3×FLAG-CMV-10載體。見圖1。

圖1 Homer1基因真核表達重組質粒序列與GenBank中檢索的Homer1基因cDNA序列比對結果

2.4 各組Homer1蛋白表達比較 p3×FLAG-CMV-10-Homer1重組質粒組、p3×FLAG-CMV-10空載體組、空白對照組Homer1蛋白相對表達量分別為4.91±0.87、1.27±0.42、0.80±0.28。p3×FLAG-CMV-10-Homer1重組質粒組Homer1蛋白相對表達量明顯高于p3×FLAG-CMV-10空載體組、空白對照組(P均<0.05)，而p3×FLAG-CMV-10空載體組與空白對照組Homer1蛋白相對表達量比較P>0.05。

3 討論

Homer1蛋白是一種常見的骨架蛋白，主要由短類型Homer1a和長類型Homer1b/c組成。Homer1蛋白廣泛存在于腦組織、心肌和骨骼肌中，其在神經系統中作為突觸后支架蛋白被廣泛研究[11]。Homer1蛋白可與多種鈣離子通道蛋白結合，如內質網鈣通道蛋白、三磷酸肌醇受體、mGluRs等[12]，能夠改變細胞內外Ca2+水平，調節突觸膜電位，改變突觸可塑性。研究發現，谷氨酸過度釋放能夠使神經元興奮過度，可能會導致神經元死亡，而Homer1a蛋白通過降低Ca2+內流，減少氧化應激、降低N-甲基-D天冬氨酸(NMDA)受體下游信號通路活性、改變NMDA受體在細胞膜上的分布，從而對神經元起到保護作用[13]。

AD的主要病理改變是神經元細胞內Aβ沉積和神經元細胞外Tau蛋白高度磷酸化形成的神經纖維纏結。Aβ沉積和神經纖維纏結能夠加速神經元不可逆性死亡，AD患者逐漸出現記憶力下降、失語、認知功能障礙等，最終發展為癡呆[14]。目前對AD藥物治療的主要研究方向集中在如何清除腦內Aβ沉積，減少神經元死亡。最近有研究對AD小鼠腹腔長期注射Ca2+通道抑制劑1，4-二氫吡啶衍生物AP-12后發現，小鼠空間學習記憶能力顯著改善，其大腦扣帶回和海馬中發現谷氨酸脫羧酶67和囊泡型γ氨基丁酸轉運體表達增加，雖然海馬內Homer1表達無明顯變化，但扣帶回Homer1表達明顯升高[15]。這為AD的治療提供了一個新的方向，即利用Ca2+通道抑制劑阻斷大腦Ca2+通道，調節突觸可塑性，進而改善記憶功能。

本研究首先構建了Homer1基因真核表達重組質粒，含酶切位點的Homer1基因序列經PCR擴增和1%瓊脂糖凝膠電泳分離發現，擴增產物片段大小與目的基因片段大小一致；經雙酶切和1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統中紫外燈下可見1 064 bp處的Homer1目的片段和6 200 bp處的p3×FLAG-CMV-10載體片段；酶切鑒定陽性的Homer1基因真核表達重組質粒經生工生物工程(上海)股份有限公司測序并與GenBank中檢索的Homer1基因cDNA序列進行比對，證實Homer1基因中插入了p3×FLAG-CMV-10載體。以上結果表明，Homer1基因真核表達重組質粒構建成功。

HT22細胞是一種永生化的小鼠海馬神經元細胞，具有典型的神經元形態和特征，被廣泛用于AD、帕金森病等神經退行性疾病的基礎研究[16]。由于小鼠原代神經元取材困難且不能傳代培養，通常用HT22細胞代替小鼠原代神經元進行實驗。本研究將Homer1基因真核表達重組質粒轉染HT22細胞，使HT22細胞Homer1蛋白過表達，進而研究Homer1蛋白在小鼠海馬神經元中對Aβ、Tau蛋白及腦內Ca2+通道的影響。結果發現，p3×FLAG-CMV-10-Homer1重組質粒組Homer1蛋白相對表達量明顯高于p3×FLAG-CMV-10空載體組、空白對照組，而p3×FLAG-CMV-10空載體組與空白對照組Homer1蛋白相對表達量比較差異無統計學意義，提示本研究構建的Homer1基因真核表達重組質粒能夠轉染入小鼠海馬神經元。

綜上所述，本研究成功構建了p3×FLAG-CMV-10-Homer1基因真核表達重組質粒，并成功轉染入HT22細胞，這為研究Homer1蛋白對腦內Aβ清除的影響及在AD發病機制中的作用奠定了基礎。