胃癌組織lncRNA XIST、miR-337-3p表達變化及其臨床意義

曹曉智，高恬媛，汪俊茹

皖南醫學院第二附屬醫院，安徽蕪湖241000

胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，是全球范圍內第二大癌癥死亡原因[1]。胃癌早期臨床癥狀不明顯，多數患者就診時病情已進展至中晚期，很多治療手段并不能獲得令人滿意的效果。胃癌的發生是一個多因素參與的復雜生物學過程，其確切的分子機制尚不明確[2]。近年研究發現，一些非編碼RNA(ncRNA)在胃癌的發生、發展過程中發揮重要作用[2]。ncRNA包括長鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)[3]。Hu等[4]研究報道，lncRNA在多種惡性腫瘤細胞中異常表達，如乳腺癌、宮頸癌。lncRNA X染色體失活特異轉錄本(XIST)是lncRNA家族成員之一，能夠參與一條X染色體沉默，在女性發育過程中具有重要作用，如促進女性第二特征發育。Mo等[5]研究發現，lncRNA XIST異常表達能夠參與惡性腫瘤的發生，如lncRNA XIST通過調控miR-139-5p/PDK1促進肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移。Fang等[6]研究發現，在非小細胞肺癌細胞中lncRNA XIST表達上調，敲低lncRNA XIST表達能夠抑制其增殖、侵襲和遷移。miRNA是一類長度為19～23個核苷酸的單鏈ncRNA，廣泛參與基因轉錄后的表達調控[7]。研究發現，miRNA不僅能參與細胞增殖、分化、凋亡等一系列重要的生命過程，其異常表達與腫瘤的發生、發展密切相關[8]。miR-337-3p屬于miRNA家族成員之一，其異常表達能夠通過抑制MMP-14轉錄，進而抑制神經細胞瘤的發生、發展[9，10]。但lncRNA XIST、miR-337-3p在胃癌發生、發展中的作用尚不明確。2018年1月～2019年5月，我們觀察了胃癌組織lncRNA XIST、miR-337-3p表達變化，并探討其臨床意義。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期皖南醫學院第二附屬醫院收治的胃癌患者79例。所有患者經活檢或術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合胃癌診斷標準；②初診；③入院前未行任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料和術后隨訪資料完整。排除標準：①合并其他消化系統疾病者，如胃炎、胃潰瘍；②合并其他部位惡性腫瘤者；③合并心、腦、腎等重要臟器嚴重疾病者；④合并免疫功能缺陷性疾病者。其中，男46例，女33例；年齡41～69(60.3±2.6)歲，<60歲45例、≥60歲34例；腫瘤直徑：<4.5 cm 38例，≥4.5 cm 41例；組織分化程度[11]：中低分化51例，高分化28例；TNM分期[11]：Ⅰ、Ⅱ期43例，Ⅲ、Ⅳ期36例；有淋巴結轉移40例，無淋巴結轉移39例。本研究經皖南醫學院第二附屬醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 lncRNA XIST、miR-337-3p表達檢測 采用RT-qPCR法。收集活檢或手術切除的胃癌組織及其配對的癌旁組織(距腫瘤組織邊緣≥5 cm，且經組織病理檢查證實為正常胃組織)，置于凍存管中，液氮下轉運至-70 ℃冰箱保存，待組織成批。取凍存組織各約50 g，液氮下研磨成粉，采用TRIzol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計鑒定，提取的組織總RNA濃度和純度合格，可用于后續實驗。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：25 ℃ 10 min，50 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按Direct PCR Kit說明進行PCR擴增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。引物序列：lncRNA XIST上游引物5′-CTCTCCATTGGGTTCAC-3′、下游引物5′-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3′，內參GAPDH上游引物5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′、下游引物5′-CAAAGTTGTCATGGATGATCC-3′；miR-337-3p上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGCTCCTATATGATGC-3′、下游引物5′-ACTCCACGACACCAGTTGAG-3′，內參U6上游引物5′-GAGGCACAGCGGAACG-3′、下游引物5′-CTACCACATAGTCCAGG-3′。PCR反應體系共20 μL：2× Direct PCR Mix 10 μL，Hot Start DNA Polymerase 0.5 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O補足至20 μL；反應條件：95 ℃預變性5 min，55 ℃變性1 min、72 ℃延伸10 s共40個循環。以GAPDH或U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算lncRNA XIST或miR-337-3p相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織lncRNA XIST、miR-337-3p表達比較 胃癌組織與癌旁正常組織lncRNA XIST相對表達量分別為0.812±0.114、0.508±0.084，miR-337-3p相對表達量分別為0.306±0.121、0.673±0.210。胃癌組織lncRNA XIST相對表達量高于癌旁正常組織，miR-337-3p相對表達量低于癌旁正常組織(t分別為19.081、13.459，P均<0.05)。

2.2 胃癌組織lncRNA XIST表達與miR-337-3p表達的關系 Pearson線性相關分析顯示，胃癌組織lncRNA XIST相對表達量與miR-337-3p相對表達量呈負相關關系(r=-0.672，P<0.05)。

2.3 胃癌組織lncRNA XIST、miR-337-3p表達與患者臨床病理特征的關系 胃癌組織lncRNA XIST、miR-337-3p相對表達量均與TNM分期、組織分化程度、淋巴結轉移有關(P均<0.05)，與性別、年齡、腫瘤直徑無關(P均>0.05)。見表1。

表1 胃癌組織lncRNA XIST、miR-337-3p表達與患者臨床病理特征的關系

3 討論

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率一直居高不下[12]。手術切術是胃癌唯一能夠達到根治目的的治療手段，但胃癌早期臨床癥狀不明顯，多數患者就診時病情已進展至中晚期，錯過了根治性手術的最佳時機，只能通過放療、化療、分子靶向治療等手段控制病情。雖然近年來放化療水平不斷提高，但并未明顯延長中晚期胃癌患者的生存期。分子靶向治療的興起為中晚期胃癌提供了新的治療策略，但目前胃癌發生、發展確切的分子機制尚不清楚，缺少有效的治療靶點。因此，探索胃癌發生、發展的分子機制，尋找其早期診斷、靶向治療和預后評估的分子生物標志物，成為國內外研究的重點和熱點。

lncRNA是一類轉錄本長度超過200 bp的ncRNA，雖然不編碼蛋白，但能在表觀遺傳調控、轉錄調控及轉錄后調控水平調控基因的表達。有研究報道，lncRNA表達和功能異常與多種惡性腫瘤的發生、發展密切相關，如乳腺癌、結腸癌[13]。lncRNA XIST是一種源自XIST基因的lncRNA，能夠參與一條X染色體沉默，在女性發育過程中具有重要作用，如促進女性第二特征發育。有研究報道，在多種惡性腫瘤細胞中lncRNA XIST表達上調，如卵巢癌、神經膠質瘤，并且其過表達能夠促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[13～15]。以上研究結果提示，lncRNA XIST有可能作為癌基因參與惡性腫瘤的發生、發展。本研究結果發現，胃癌組織lncRNA XIST相對表達量高于癌旁正常組織，提示在胃癌組織中lncRNA XIST表達上調。本研究結果還發現，胃癌組織lncRNA XIST相對表達量與TNM分期、組織分化程度、淋巴結轉移有關，與性別、年齡、腫瘤直徑無關，提示lncRNA XIST表達上調與胃癌的惡性進展有關。lncRNA XIST作為競爭性內源RNA競爭抑制miRNA，通過調控miR-337-3p、miR-185等促進胃癌的發生、發展。miR-185的下游靶基因是TGF-β1，TGF-β1能夠參與炎癥反應、血管生成、組織纖維化等病理生理過程，在腫瘤的發生、發展過程中具有重要作用[16]。上調miR-185能夠促進TGF-β1表達，繼而促進腫瘤周圍血管形成，為腫瘤細胞生長提供豐富的營養物質，從而促進腫瘤惡性進展。有研究報道，lncRNA XIST是Rap GTPases的激活劑，而Rap GTPases是細胞運動、黏附的主要調節劑；Rap GTPases被激活后，能夠使B淋巴細胞在細胞內外自行出入和內皮細胞之間遷移[9]。因此，lncRNA XIST過表達能夠促進腫瘤細胞的淋巴結轉移，從而提高腫瘤的惡性程度。

miRNA是一類長度為19～23個核苷酸的單鏈ncRNA，廣泛參與基因轉錄后的表達調控[7]。研究發現，miRNA不僅能參與細胞增殖、分化、凋亡等一系列重要的生命過程，其異常表達與腫瘤的發生、發展密切相關[8]。miR-337-3p屬于miRNA家族成員之一，定位于染色體14q32.2，在腎透明細胞癌、神經細胞瘤等惡性腫瘤細胞中異常表達。有研究報道，miR-337-3p能夠通過抑制髓樣鋅指蛋白1(MZF1)介導的MMP-14表達，抑制惡性腫瘤的發生、發展[17，18]。由此推測，miR-337-3p可能作為抑癌基因參與腫瘤的發生、發展。本研究結果顯示，胃癌組織miR-337-3p相對表達量低于癌旁正常組織，提示在胃癌組織中miR-337-3p表達下調。本研究還發現，胃癌組織miR-337-3p相對表達量與TNM分期、組織分化程度、淋巴結轉移有關，與性別、年齡、腫瘤直徑無關，提示miR-337-3p表達下調與胃癌的惡性進展有關。MMP-14能夠通過降解細胞外基質或激活MMP-2，促進腫瘤細胞的侵襲和遷移[17]。miR-337-3p能夠與MMP-14的啟動子結合，進而抑制基因的轉錄和翻譯。miR-337-3p表達降低促進了腫瘤磁暴DNA的轉錄與翻譯過程，從而促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等。MZF1直接與p55PIK啟動子結合以激活其表達，并充當腫瘤細胞的生長激活劑，從而促進腫瘤細胞的惡性增殖。MMP-14是MZF1下游靶基因，miR-337-3p能夠抑制MMP-14表達，間接使MZF1表達代償性上調，從而促進了腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等[18]。

有研究認為，miR-337-3p是lncRNA XIST的靶基因，當lncRNA XIST抑制miR-337-3p表達時，miR-337-3p的抑癌作用減弱，間接促進了腫瘤的惡性進展[19，20]。本研究結果發現，胃癌組織lncRNA XIST相對表達量與miR-337-3p相對表達量呈負相關關系，進一步證實lncRNA XIST通過抑制miR-337-3p表達，從而促進胃癌的發生、發展。

綜上所述，胃癌組織lncRNA XIST高表達、miR-337-3p低表達，二者表達呈負相關關系，并且二者共同參與胃癌的發生、發展。lncRNA XIST、miR-337-3p有望成為胃癌早期診斷和靶向治療的分子生物標志物。