乳腺癌組織lncRNA TUG1、EZH2表達變化及其臨床意義

段學軍，宋慶宏，郭俊龍

1 天津市寧河區醫院，天津301500；2 天津市人民醫院

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是近年發現的一類轉錄本長度超過200 nt的RNA分子，它們并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在表觀遺傳調控、轉錄調控和轉錄后調控層面上調控基因的表達。lncRNA不僅能參與調控正常細胞的增殖、分化、凋亡等，還能通過調控腫瘤生長、浸潤、轉移等影響腫瘤的發生、發展[1]。牛磺酸上調基因1(TUG1)屬于lncRNA家族成員之一，定位于人染色體22q12.2，由3個外顯子組成。有研究報道，lncRNA TUG1在宮頸癌、非小細胞肺癌、胃癌等惡性腫瘤細胞增殖過程中發揮重要作用[2]。Ren等[3]研究發現，lncRNA TUG1高表達胃癌患者生存時間較其低表達胃癌患者明顯縮短，表明lncRNA TUG1可作為評估胃癌患者預后的生物學指標。組蛋白甲基化轉移酶2(EZH2)作為PCG基因家族的核心成員之一，能夠通過參與染色質的形成而調控基因的轉錄過程。當EZH2高表達時，染色質中的靶基因被抑制表達，能夠促進腫瘤細胞的侵襲和遷移，從而導致患者預后不佳[4]。有研究發現，lncRNA TUG1能夠通過調控EZH2介導的甲基化調節效應因子，沉默抑癌基因表達，導致惡性腫瘤進展[5]。但目前鮮見乳腺癌組織lncRNA TUG1、EZH2表達的報道。為此，本研究觀察了乳腺癌組織lncRNA TUG1、EZH2表達變化，并探討其臨床意義?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年4月～2017年1月天津市寧河區醫院收治的乳腺癌患者83例。所有患者經術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合原發性乳腺癌診斷標準，女性；②接受乳腺癌改良根治術；③初診，術前未接受任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標準：①合并其他器官或系統惡性腫瘤者；②預計生存時間≤3個月者；③合并嚴重心肺功能不全者?；颊吣挲g35～74歲，其中<60歲39例、≥60歲44例；有乳腺癌家族史18例，無乳腺癌家族史65例；腫瘤直徑：<2.5 cm 30例，≥2.5 cm 53例；組織分化程度：低分化32例，中高分化51例；TNM分期[6]：Ⅰ、Ⅱ期55例，Ⅲ期28例；有淋巴結轉移44例，無淋巴結轉移39例。本研究經天津市寧河區醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 lncRNA TUG1、EZH2表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。取手術切除的乳腺癌組織及其配對的癌旁正常組織各約100 mg，采用TRIzol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續實驗。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明，將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：35 ℃ 15 min，80 ℃ 10 s。以cDNA為模板，按SYBRGreen Premix Ex Taq Kit說明進行PCR擴增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。lncRNA TUG1上游引物5′-TAGCAGTT-CCCCAATCCTTG-3′、下游引物5′-CACAAATTCCCATCATTCCC-3′，內參U6上游引物5′-AGTCACGACGCTCACGAGACC-3′、下游引物5′-GACGATCCCCGCGACTACCAAAC-3′；EZH2上游引物5′-CCCGGGACAACGTTTATTAC-3′、下游引物5′-GCTGGCTCAAGTCAAAGTCC-3′，內參GAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR反應體系共20 μL：2×SYBRGreen Premix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，去離子水6 μL；反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s共40個循環。以U6或GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算lncRNA TUG1或EZH2相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者出院后采用門診復查或電話回訪等形式定期隨訪，隨訪截至2019年12月31日，以末次隨訪、患者死亡或失訪為終點，統計患者生存情況。

2 結果

2.1 乳腺癌組織與癌旁正常組織lncRNA TUG1、EZH2表達比較 乳腺癌組織與癌旁正常組織lncRNA TUG1相對表達量分別為6.35±0.19、1.98±0.27，EZH2相對表達量分別為1.25±0.09、0.44±0.05。乳腺癌組織lncRNA TUG1、EZH2相對表達量均高于癌旁正常組織(t分別為120.589、71.676，P均<0.01)。

2.2 乳腺癌組織lncRNA TUG1表達與EZH2表達的關系 Pearson相關分析顯示，乳腺癌組織lncRNA TUG1相對表達量與EZH2相對表達量呈正相關關系(r=0.573，P<0.01)。

2.3 乳腺癌組織lncRNA TUG1、EZH2表達與患者臨床病理特征的關系 見表1。

表1 乳腺癌組織lncRNA TUG1、EZH2表達與患者臨床病理特征的關系

2.4 乳腺癌組織lncRNA TUG1、EZH2表達與患者預后的關系 至隨訪截至日期，共隨訪1～36個月，無失訪病例，隨訪期間死亡18例。

以乳腺癌組織lncRNA TUG1相對表達量的中位數6.37為臨界值，將患者分為lncRNA TUG1高表達者46例、lncRNA TUG1低表達者37例。lncRNA TUG1高表達者3年生存率為69.57%(32/46)，lncRNA TUG1低表達者為89.19%(33/37)，lncRNA TUG1高表達者3年生存率低于lncRNA TUG1低表達者(χ2=4.650，P<0.05)。

以乳腺癌組織EZH2相對表達量的中位數1.22為臨界值，將患者分為EZH2高表達者43例、EZH2低表達者40例。EZH2高表達者3年生存率為65.12%(28/43)，EZH2低表達者為92.50%(37/40)。EZH2高表達者3年生存率低于EZH2低表達者(χ2=9.150，P<0.05)。

3 討論

乳腺癌是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤之一，近年來其發病率明顯上升并呈年輕化趨勢[7]。乳腺癌的發生、發展是一個多基因參與的復雜生物學過程，涉及多種原癌基因激活和抑癌基因失活，但其確切分子機制尚不完全清楚。因此，深入研究乳腺癌的發病機制對其早期診斷、靶向治療和預后判斷具有重要意義。

lncRNA是非編碼RNA家族中的重要成員，能夠在表觀遺傳調控、轉錄調控和轉錄后調控層面上調控基因的表達，從而廣泛參與細胞內復雜的生物學過程。近年研究證實，lncRNA可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發生、發展[1，3]。lncRNA TUG1定位于人染色體22q12.2，最初在小鼠視網膜細胞中被發現。有研究報道，lncRNA TUG1在多種惡性腫瘤組織中表達失調，并可作為評估患者預后的有效指標[8]。Baratieh等[2]研究發現，lncRNA TUG1在胃癌組織中高表達；lncRNA TUG1通過結合PCR2調控細胞周期轉變，從而促進胃癌細胞侵襲和遷移。lncRNA TUG1還可通過甲基化修飾來抑制p27表達，從而促進乳腺癌細胞增殖、分化，故lncRNA TUG1高表達提示乳腺癌患者預后較差。本研究結果顯示，乳腺癌組織lncRNA TUG1相對表達量明顯高于癌旁正常組織，提示lncRNA TUG1可能參與乳腺癌的發生、發展。Li等[9]研究發現，沉默lncRNA TUG1表達能夠抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移并促進其凋亡，表明lncRNA TUG1在乳腺癌的發生、發展中可能具有癌基因作用。本研究乳腺癌組織lncRNA TUG1表達與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移有關，而與患者年齡、乳腺癌家族史、腫瘤直徑、組織分化程度無關，進一步證實lncRNA TUG1高表達與腫瘤惡性進展有關。本研究以乳腺癌組織lncRNA TUG1相對表達量的中位數為臨界值，將患者分為lncRNA TUG1高表達者與低表達者，結果發現lncRNA TUG1高表達者3年生存率低于lncRNA TUG1低表達者，表明lncRNA TUG1高表達預示乳腺癌患者預后不良。因此，lncRNA TUG1可作為評估乳腺癌患者預后的分子生物標志物。

EZH2定位于人染色體7q35，是PCG基因家族的核心成員之一。EZH2可通過特異性催化H3K27me3，調控Wnt、Notch等信號通路基因的表達，抑制細胞衰老并促進上皮間質轉化，與惡性腫瘤的發生、發展密切相關。有研究報道，EZH2在肺癌、子宮內膜癌、胃癌等惡性腫瘤組織中高表達，且其高表達與患者預后較差密切相關[10～12]。Yomtoubian等[13]研究發現，EZH2在乳腺癌的發生、發展中具有癌基因作用，有可能成為預測乳腺癌患者轉移風險的潛在分子標志物。本研究結果顯示，乳腺癌組織EZH2相對表達量高于癌旁正常組織，提示EZH2可能參與乳腺癌的發生、發展。Raaphorst等[14]研究發現，在正常乳腺組織中EZH2表達較低，而在乳腺癌組織中EZH2表達明顯升高，提示EZH2高表達可能導致乳腺癌細胞向低分化發展。Luo等[15]研究發現，EZH2可能通過特異性催化H3K27me3抑制E-cadherin在咽喉部鱗癌細胞中的表達，促進上皮間質轉化，導致鱗癌細胞侵襲和遷移。本研究發現，乳腺癌組織EZH2相對表達量與腫瘤組織分化程度、淋巴結轉移有關，與患者年齡、乳腺癌家族史、腫瘤直徑、TNM分期無關，提示EZH2高表達能夠促進乳腺癌惡性進展。本研究以乳腺癌組織EZH2相對表達量的中位數為臨界值，將患者分為EZH2高表達者與低表達者，結果發現EZH2高表達者3年生存率低于EZH2低表達者，提示EZH2高表達與乳腺癌患者預后不佳有關。因此，EZH2可作為評估乳腺癌患者預后的分子生物標志物。

本研究乳腺癌組織lncRNA TUG1相對表達量與EZH2相對表達量呈正相關關系，提示lncRNA TUG1與EZH2可能共同調控乳腺癌的發生、發展。有研究報道，lncRNA NEAT1能夠通過調節依賴miR-101的EZH2，促進乳腺癌細胞增殖[16]。因此，lncRNA/EZH2通路可能在乳腺癌的發生、發展中發揮重要作用。但lncRNA TUG1與EZH2具體的調控關系尚不清楚，有待于進一步研究。

綜上所述，乳腺癌組織lncRNA TUG1、EZH2表達升高，且二者表達呈正相關關系；lncRNA TUG1、EZH2表達升高與乳腺癌惡性進展和患者預后不良有關。