三陰乳腺癌組織Ki-67、miR-155、MUC1表達變化及其臨床意義

王延濤，陳偉娜

青島市第八人民醫院，山東青島266100

三陰乳腺癌(TNBC)是乳腺癌的一種特殊亞型，占所有乳腺癌的15%～20%。與其他類型乳腺癌相比，TNBC具有侵襲性強、遠處轉移風險高和預后差等特點[1]。細胞核增殖相關抗原Ki-67是在增殖細胞中表達的一種核抗原，與細胞有絲分裂有關。研究發現，Ki-67表達變化與多種腫瘤的浸潤、轉移密切相關[2]。王仙玲[3]研究發現，在TNBC組織中Ki-67高表達，而Ki-67低表達是TNBC患者無病生存期延長的保護性因素。微小RNA-155(miR-155)是miRNA家族成員之一。有研究發現，miR-155在乳腺癌診斷和預后評估中具有潛在的應用價值[4]。段衛明等[5]認為，miR-155可作為預測TNBC患者術后復發的生物標志物。黏蛋白1(MUC1)是分布于機體正常黏膜表面的高分子量糖蛋白，其分子由肽核心和糖鏈組成，對正常上皮組織具有潤滑和保護作用。近年研究發現，MUC1是一種重要的腫瘤相關抗原，與腫瘤細胞的增殖、浸潤和遷移有關[6，7]。但目前Ki-67、miR-155、MUC1表達與TNBC發生、發展關系的報道相對較少。為此，本研究觀察了TNBC組織Ki-67、miR-155、MUC1表達變化，并探討其臨床意義。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年1～12月青島市第八人民醫院收治的TNBC患者85例。所有患者經術后病理組織學檢查明確乳腺癌診斷[8]，免疫組化染色提示雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長因子受體2(HER-2)均陰性，符合TNBC。納入標準：①符合TNBC診斷；②初診，術前未接受任何抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤者；②男性；③有家族遺傳性疾病者。患者年齡38～64(51.23±6.47)歲，其中<50歲42例、≥50歲43例；絕經38例，未絕經47例；組織分化程度：低分化16例，中分化18例，高分化51例；腫瘤直徑：≤2 cm 27例，>2 cm 58例；臨床分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期27例，Ⅲ期34例；有淋巴結轉移36例，無淋巴結轉移49例。本研究經青島市第八人民醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 Ki-67、MUC1表達檢測 采用免疫組化法。取手術切除的TNBC組織及其配對的癌旁正常組織，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚連續切片。切片經70 ℃烘箱烤片2 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3% H2O2滅活內源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液中高溫高壓修復抗原，自然冷卻至室溫。正常山羊血清工作液封閉，然后滴加鼠抗人Ki-67、MUC1單克隆抗體，37 ℃孵育2 h，滴加生物素標記的羊抗人IgG二抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。以羊抗人IgG代替一抗作為陰性對照，已知Ki-67、MUC1陽性標本作為陽性對照。

采用雙盲法由兩位病理科醫師獨立閱片。Ki-67陽性染色定位于細胞核，呈棕黃色顆粒；MUC1陽性染色定位于細胞質，呈棕黃色顆粒。每張切片隨機選取5個200倍視野，評估每視野染色強度；每視野計數1 000個細胞，計算陽性細胞比例。染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞比例評分：<5%為0分，5%～<25%為1分，25%～<50%為2分，50%～<75%為3分，≥75%為4分。以染色強度評分和陽性細胞比例評分綜合評定陽性表達，二者乘積>4為陽性表達。

1.3 miR-155表達檢測 采用RT-PCR法。取手術切除的TNBC組織及其配對的癌旁正常組織，采用TRIzol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA純度和濃度合格，可用于后續實驗。按PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明將總RNA反轉錄為cDNA。反轉錄條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。以cDNA為模板，按2×SYBR Green qPCR Mix說明進行PCR擴增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。引物序列：miR-155上游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAG-3′，下游引物5′-ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGAT-3′；內參U6上游引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA-3′，下游引物5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′。PCR反應體系共20 μL：2×SYBRGreen qPCR Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，RNase Free H2O 8.2 μL；反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 10 s共40個循環。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 TNBC組織與癌旁正常組織Ki-67、miR-155、MUC1表達比較 TNBC組織與癌旁正常組織Ki-67陽性表達率分別為80.00%(68/85)、56.47%(48/85)，miR-155相對表達量分別為1.32±0.17、0.76±0.23，MUC1陽性表達率分別為77.65%(66/85)、62.35%(53/85)。TNBC組織Ki-67、MUC1陽性表達率均高于癌旁正常組織(χ2分別為10.856、4.734，P均<0.05)，miR-155相對表達量亦高于癌旁正常組織(t=18.052，P<0.05)。

2.2 TNBC組織Ki-67、miR-155、MUC1表達與患者臨床病理特征的關系 見表1。

表1 TNBC組織Ki-67、miR-155、MUC1表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 TNBC組織Ki-67、miR-155、MUC1表達的關系 Spearman等級相關分析顯示，TNBC組織Ki-67表達與miR-155、MUC1表達均呈正相關關系(r分別為0.713、0.647，P均<0.05)，miR-155表達與MUC1表達亦呈正相關關系(r=0.596，P<0.05)。

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，約占女性惡性腫瘤的30%，已成為威脅女性健康的主要病因。TNBC是乳腺癌的一種特殊亞型，占所有乳腺癌的15%～20%。與其他類型乳腺癌相比，TNBC具有侵襲性強、遠處轉移風險高和預后差等特點。由于TNBC的激素受體和HER-2受體均陰性，無內分泌治療和抗HER-2受體靶向治療指征，聯合化療成為其內科治療的主要手段，但常規化療往往效果不佳，而化療效果不佳的TNBC患者2年內復發的風險較高，預后和生存狀況較差。因此，尋找TNBC新的治療靶點成為近年研究的熱點。

Ki-67是一種非組蛋白性核蛋白，存在于具有增殖活性的細胞核中，與細胞有絲分裂密切相關，是反映細胞群體增殖活性的良好指標。研究發現，Ki-67表達變化與多種腫瘤的浸潤、轉移密切相關[2]；Ki-67表達越高，腫瘤惡性程度越高，越容易發生侵襲和轉移[9，10]。邢芳林等[11]研究發現，TNBC患者Ki-67陽性指數明顯高于非TNBC患者，推測Ki-67可作為預測腫瘤生物學行為和判斷患者預后的生物學指標。本研究結果發現，TNBC組織Ki-67陽性表達率明顯高于癌旁正常組織；TNBC組織Ki-67陽性表達與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移有關，而與患者年齡、絕經狀態、腫瘤直徑和組織分化程度無關。提示TNBC組織Ki-67高表達，其表達變化與TNBC的發生、發展密切相關。

miRNA是一類短序列、非編碼單鏈小分子RNA，其轉錄后能夠參與基因表達的調控，從而影響生物體內細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程。miR-155作為miRNA家族成員之一，基因定位于染色體21q21，在甲狀腺癌、胰腺癌、肺癌等惡性腫瘤組織中異常表達，被認為是一種癌性miRNA[12]。有研究發現，miR-155能夠改變人乳腺癌MCF-7細胞轉錄組，激活絲裂原活化蛋白激酶信號，參與乳腺癌的惡性轉化[13]。Kia等[14]研究發現，miR-155可通過抑制性別決定區Y框蛋白表達促進TNBC細胞的增殖、侵襲和遷移。本研究結果發現，TNBC組織miR-155相對表達量明顯高于癌旁正常組織；TNBC組織miR-155表達與腫瘤組織分化程度、淋巴結轉移有關，與患者年齡、絕經狀態、腫瘤直徑和臨床分期無關，與謝小紅等[15]研究結果一致。提示TNBC組織miR-155表達升高，其表達變化與TNBC的發生、發展有關。

MUC1為異源二聚體跨膜糖蛋白，編碼基因定位于染色體1q21，含有7個外顯子。正常情況下，MUC1主要表達于組織、器官上皮細胞近管腔或腺腔面，如胃腸道、泌尿生殖道、乳腺等，呈極性分布，具有潤滑和保護上皮組織作用。近年研究發現，MUC1還能介導細胞與細胞、細胞與基質間的相互黏附，從而參與腫瘤的侵襲和轉移，在多種上皮細胞來源的惡性腫瘤中異常表達[16]。Sun等[17]研究報道，90%以上的乳腺癌組織MUC1過表達。本研究發現，TNBC組織MUC1陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，進一步證實TNBC組織MUC1高表達。孟迪等[18]研究表明，MUC1在TNBC組織中不存在表達優勢，且與患者預后相關的臨床病理特征無關，如臨床分期、組織分化程度、淋巴結轉移等。本研究結果發現，TNBC組織MUC1表達與腫瘤淋巴結轉移有關，與患者年齡、絕經狀態、組織分化程度、腫瘤直徑、臨床分期無關，與孟迪等[18]報道并不一致。有研究認為，當細胞癌變時MUC1的極性分布被破壞，細胞表面分子間的黏附作用降低，導致腫瘤細胞遷移[19]。因此，TNBC組織MUC1表達變化與TNBC的發生、發展有關。

本研究結果還發現，TNBC組織Ki-67表達與miR-155、MUC1表達均呈正相關關系，miR-155表達與MUC1表達亦呈正相關關系，提示Ki-67、miR-155、MUC1共同參與了TNBC的發生、發展。但目前三者在TNBC中相互作用的機制尚不清楚，還有待于進一步研究。

綜上所述，TNBC組織Ki-67、miR-155、MUC1表達明顯升高，三者可能共同參與TNBC的發生、發展。由于本研究未觀察TNBC組織與其他類型乳腺癌組織Ki-67、miR-155、MUC1表達變化，Ki-67、miR-155、MUC1能否作為TNBC診斷、治療和預后評估的生物標志物尚不清楚，還需今后進一步研究。