S100β基因單核苷酸多態(tài)性對(duì)miRNA靶向調(diào)控的影響

楊漪霞，王家豐，李克深，2

1 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東湛江524000；2 暨南大學(xué)華僑醫(yī)院

阿爾茨海默病(AD)是癡呆最常見(jiàn)的類型，占所有癡呆的50%～75%，也是目前老年人中最常見(jiàn)的致死原因[1]。AD的神經(jīng)病理學(xué)特征主要是β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失[2，3]。中樞神經(jīng)特異蛋白(S100β)是一種鈣結(jié)合蛋白，是S100蛋白家族成員之一，在腦組織高度表達(dá)，主要存在于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，對(duì)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生旁分泌和自分泌作用[4]。Barger等[5]研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦內(nèi)淀粉樣斑塊存在S100β異常表達(dá)。有研究報(bào)道，S100β基因3′非編碼區(qū)(3′UTR)多態(tài)性與人血清和額葉皮質(zhì)中較高的S100β含量有關(guān)[6，7]。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)，中國(guó)漢族人群S100β基因多態(tài)性可能與AD易感性密切相關(guān)。這些研究提示S100β可能參與AD的發(fā)病過(guò)程。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA，長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸，主要通過(guò)與靶mRNA 3′UTR的堿基配對(duì)，引起靶mRNA降解或翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白的表達(dá)[8]。miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富，其異常表達(dá)與一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9]。因此，miRNA可能通過(guò)與S100β基因3′UTR堿基配對(duì)，從而參與mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。2019年6月～2020年1月，本研究擬篩選驗(yàn)證S100β基因3′UTR rs9722位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)miRNA靶向調(diào)控效率的影響，旨在為AD的精準(zhǔn)醫(yī)療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚腎293T細(xì)胞、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞(以下分別稱293T細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞)，購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p，購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。S100β-rs9722C、S100β-rs9722T、S100β-rs9722C突變型(S100β-rs9722C-mut)基因型載體，購(gòu)自上海艾博思生物科技有限公司。熒光定量PCR儀，購(gòu)自瑞士Roche公司；酶標(biāo)儀，購(gòu)自德國(guó)Berthold公司；All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit、All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit，購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司；Dual-LumiTMⅡ雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗S100β一抗，美國(guó)Cell Signaling Technology公司；鼠抗GAPDH一抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 miRNA與S100β基因靶向調(diào)控關(guān)系預(yù)測(cè) 利用TargetScan在線軟件(http：//www.targetscan.org/vert_71/)，根據(jù)人S100β基因3′UTR序列，尋找調(diào)控S100β基因的miRNA及其配對(duì)結(jié)合的位點(diǎn)。

1.3 S100β基因rs9722位點(diǎn)不同基因型載體構(gòu)建 根據(jù)S100β基因的序列及3′UTR多態(tài)性位點(diǎn)的序列，構(gòu)建S100β基因rs9722位點(diǎn)的不同基因型載體：S100β-rs9722C、S100β-rs9722T、S100β-rs9722C-mut。PCR產(chǎn)物兩端分別設(shè)計(jì)ApaI、SaII的酶切位點(diǎn)。S100β基因3′UTR的rs9722C、rs9722T、rs9722C-mut片段擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切，并連接至pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告基因載體上，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑選陽(yáng)性克隆菌落雙酶切后測(cè)序。

1.4 雙熒光素酶活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293T細(xì)胞，接種至24孔板，每孔5×104個(gè)，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合60%以上時(shí)，按Lipofectamine3000說(shuō)明，將3′UTR雙熒光素酶質(zhì)粒(S100β-rs9722C、S100β-rs9722T、S100β-rs9722C-mut)與miRNA模擬物(miRNA mimics、miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p)兩兩組合共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，分別設(shè)為rs9722C+miRNA mimics組、rs9722C+miR-340-3p組、rs9722C+miR-593-3p組、rs9722C+miR-6827-3p組、rs9722T+miRNA mimics組、rs9722T+miR-340-3p組、rs9722T+miR-593-3p組、rs9722T+miR-6827-3p組、rs9722C-mut+miRNA mimics組、rs9722C-mut+miR-340-3p組、rs9722C-mut+miR-593-3p組、rs9722C-mut+miR-6827-3p組。37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，更換新的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)液上清，按Dual-LumiTMⅡ雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)熒光素酶活性。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SH-SY5Y細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種至6孔板，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隨機(jī)將細(xì)胞分為miRNA NC組、miR-340-3p組、miR-593-3p組、miR-6827-3p組，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合70%以上時(shí)，按Lipofectamine3000說(shuō)明，分別加入miRNA mimics、miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p轉(zhuǎn)染，然后置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。

1.6 miRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。收集上述各組轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 60 min， 85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按照All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：hsa-miR-340-3p上游引物5′-ATGGTTCGTGGGTCCGTCTCAG-3′，hsa-miR-593-3p上游引物5′-ATGGTTCGTGGGTGTCTCTGC-3′，hsa-miR-6827-3p上游引物5′-ATGGTTCGTGGGACCGTCTCTTC-3′，miRNA通用下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內(nèi)參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 S100β表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集上述各組轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格后，加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白60 μg，SDS-PAGE分離蛋白。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗S100β一抗(稀釋比1∶500)、鼠抗GAPDH一抗(稀釋比1∶5 000)，4 ℃孵育過(guò)夜；次日，分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋比1∶1 000)、山羊抗鼠IgG二抗(稀釋比1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，ECL發(fā)光，暗室中曝光、顯影。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 miRNA與S100β基因的靶向調(diào)控關(guān)系 TargetScan在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p與S100β基因3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，miR-340-3p、miR-6827-3p的5′-CUCUGCC-3′序列與S100β基因3′UTR的5′-GAGACGG-3′序列完全互補(bǔ)，而miR-593-3p的5′-GUCUCUG-3′序列與S100β基因3′UTR的5′-CAGAGAC-3′序列完全互補(bǔ)。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p與S100β基因3′UTR的互補(bǔ)序列示意圖

2.2 S100β基因rs9722位點(diǎn)不同基因型載體鑒定 S100β基因rs9722位點(diǎn)S100β-rs9722C、S100β-rs9722T、S100β-rs9722C-mut序列見(jiàn)圖2。經(jīng)鑒定，3種序列的雙酶切片段大小和目的基因序列片段大小一致，見(jiàn)圖3。

注：lane1空白質(zhì)粒、lane2雙酶切后產(chǎn)物。

圖2 構(gòu)建的S100β基因rs9722位點(diǎn)各基因型載體示意圖

2.3 各組雙熒光素酶活性比較 rs9722C+miRNA mimics組、rs9722C+miR-340-3p組、rs9722C+miR-593-3p組、rs9722C+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性分別為184.70±2.96、131.40±19.57、163.00±14.75、123.10±10.02；rs9722C+miR-340-3p組、rs9722C+miR-593-3p組、rs9722C+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性均低于rs9722C+miRNA mimics組(P均<0.05)。rs9722T+miRNA mimics組、rs9722T+miR-340-3p組、rs9722T+miR-593-3p組、rs9722T+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性分別為153.70±14.29、140.80±35.84、178.80±8.93、151.90±18.33；rs9722T+miR-340-3p組、rs9722T+miR-593-3p組、rs9722T+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性與rs9722T+miRNA mimics組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。rs9722C-mut+miRNA mimics組、rs9722C-mut+miR-340-3p組、rs9722C-mut+miR-593-3p組、rs9722C-mut+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性分別為166.80±23.92、191.10±10.05、191.20±7.24、181.50±6.55；rs9722C-mut+miR-340-3p組、rs9722C-mut+miR-593-3p組、rs9722C-mut+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性與rs9722C-mut+miRNA mimics組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.4 各組轉(zhuǎn)染后相應(yīng)miRNA表達(dá)比較 miR-340-3p組及其對(duì)照miRNA NC組miR-340-3p相對(duì)表達(dá)量分別為23.94±0.80、1.00±0.02，miR-593-3p組及其對(duì)照miRNA NC組miR-593-3p相對(duì)表達(dá)量分別為39.27±1.50、1.04±0.07，miR-6827-3p組及其對(duì)照miRNA NC組miR-6827-3p相對(duì)表達(dá)量分別為205.10±15.87、1.01±0.01。miR-340-3p組、miR-593-3p組、miR-6827-3p組相應(yīng)miRNA相對(duì)表達(dá)量均高于其對(duì)照miRNA NC組(P均<0.05)。

2.5 各組轉(zhuǎn)染后S100β表達(dá)比較 miR-340-3p組及其對(duì)照miRNA NC組S100β相對(duì)表達(dá)量分別為0.45±0.10、0.59±0.05，miR-593-3p組及其對(duì)照miRNA NC組S100β相對(duì)表達(dá)量分別為0.33±0.10、0.42±0.19，miR-6827-3p組及其對(duì)照miRNA NC組S100β相對(duì)表達(dá)量分別為0.11±0.01、0.48±0.12。miR-6827-3p組S100β相對(duì)表達(dá)量低于其對(duì)照miRNA NC組(P<0.05)，而miR-340-3p組、miR-593-3p組S100β相對(duì)表達(dá)量與其對(duì)照miRNA NC組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

3 討論

AD是癡呆最常見(jiàn)的類型，但迄今為止其發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚。目前，AD的發(fā)病機(jī)制主要有Aβ蛋白沉積學(xué)說(shuō)、Tau蛋白異常磷酸化學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)等[10]。越來(lái)越多證據(jù)表明，S100蛋白家族能夠參與AD的發(fā)病。在炎癥性疾病和神經(jīng)退行性疾病中S100β表達(dá)增加。S100β在納摩爾濃度時(shí)可刺激神經(jīng)軸突生長(zhǎng)、增強(qiáng)神經(jīng)元生存能力，而在微摩爾濃度時(shí)則可增加促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡[11]。Mori等[12]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)S100β能夠加重Tg2576轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦實(shí)質(zhì)和腦血管淀粉樣蛋白沉積，促進(jìn)淀粉樣前體蛋白加工，從而影響Aβ表達(dá)。Lambert等[13]在3個(gè)獨(dú)立人群中發(fā)現(xiàn)，S100β基因rs2300403位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與認(rèn)知功能下降有關(guān)；他們?cè)?個(gè)獨(dú)立人群，特別是婦女和老年人群中，發(fā)現(xiàn)這個(gè)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與AD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。S100β的這種遺傳變異增加了罹患AD的風(fēng)險(xiǎn)，可能參與從輕度認(rèn)知功能下降到顯性癡呆的連續(xù)過(guò)程。因此推測(cè)，對(duì)S100β基因的調(diào)控有可能影響AD的發(fā)生、發(fā)展。

miRNA是廣泛存在于真核生物體內(nèi)的一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA，能夠參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異性表達(dá)，能夠參與神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育和生理功能，如胚胎神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化、突觸可塑性等[14，15]。有研究報(bào)道，miRNA在AD的發(fā)病過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用，如改變淀粉樣前體蛋白產(chǎn)生或清除、影響Tau蛋白異常磷酸化、影響突觸可塑性和受體功能障礙等[16]。在AD模型SAMP8小鼠海馬組織中miR-340表達(dá)下調(diào)，而β淀粉樣前體蛋白裂解酶1(BACE1)表達(dá)上調(diào)；過(guò)表達(dá)miR-340可降低SH-SY5Y/APPswe細(xì)胞BACE1表達(dá)[17]。提示AD模型SAMP8小鼠腦組織miR-340表達(dá)與BACE1表達(dá)可能呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，miR-340可能通過(guò)靶向調(diào)控BACE1表達(dá)進(jìn)而減少Aβ沉積。但miR-593、miR-6827與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)TargetScan在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p與S100β基因rs9722位點(diǎn)的3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，提示這3個(gè)miRNA對(duì)S100β基因rs9722位點(diǎn)可能存在靶向調(diào)控作用。通過(guò)構(gòu)建S100β基因rs9722位點(diǎn)不同基因型載體(S100β-rs9722C、S100β-rs9722T、S100β-rs9722C-mut)，經(jīng)鑒定，其雙酶切片段大小與目的基因序列片段大小一致。進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，rs9722C+miR-340-3p組、rs9722C+miR-593-3p組、rs9722C+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性均低于rs9722C+miRNA mimics組；rs9722T+miR-340-3p組、rs9722T+miR-593-3p組、rs9722T+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性與rs9722T+miRNA mimics組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；rs9722C-mut+miR-340-3p組、rs9722C-mut+miR-593-3p組、rs9722C-mut+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性與rs9722C-mut+miRNA mimics組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示miR-340-3p、miR-6827-3p能夠靶向調(diào)控S100β基因rs9722位點(diǎn)的3′UTR，但其調(diào)控效率可能存在基因型差異。為了驗(yàn)證miRNA對(duì)S100β基因的靶向調(diào)控作用，本研究將miRNA NC、miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-340-3p組、miR-593-3p組、miR-6827-3p組相應(yīng)miRNA相對(duì)表達(dá)量均高于其對(duì)照miRNA NC組，提示miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p均轉(zhuǎn)染成功。進(jìn)一步觀察各組轉(zhuǎn)染后S100β表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-6827-3p組S100β相對(duì)表達(dá)量低于其對(duì)照miRNA NC組，而miR-340-3p組、miR-593-3p組S100β相對(duì)表達(dá)量與其對(duì)照miRNA NC組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示miR-6827-3p可靶向調(diào)控S100β基因rs9722C的3′UTR，對(duì)S100β基因具有一定的調(diào)控能力。

綜上所述，miRNA對(duì)S100β基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控效率可能存在基因型差異，miR-6827-3p可能通過(guò)靶向結(jié)合S100β基因rs9722C基因型mRNA，從而調(diào)控S100β表達(dá)，進(jìn)而影響AD的易感性。