菜心小孢子培養體系的優化

趙艷艷 牛劉靜 原玉香 魏小春 楊雙娟 王志勇 張曉偉 張衍榮

摘? ? 要：為了優化菜心小孢子培養體系，以10個菜心品種為試材進行小孢子培養，研究基因型、不同培養基配方和植物生長調節劑對小孢子胚誘導率的影響。結果表明，基因型是決定菜心品種能否出胚的一個重要因素，且不同基因型試材間小孢子胚誘導率具有明顯差異，其中‘Cx1‘Cx6‘Cx8經過小孢子培養后較易獲得胚狀體，而其他材料則沒有獲得胚狀體，基因型的不同導致胚狀體誘導率在0～2.10胚·蕾-1之間;同一基因型，在不同培養基成分誘導條件下，添加活性炭對小孢子胚狀體誘導率的影響較大，胚誘導率在0.03～2.10胚·蕾-1之間;培養基中蔗糖質量濃度為130 g·L-1時，‘Cx1的胚誘導率最高;此外，在培養基中添加0.05 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1 NAA可以顯著提高菜心‘Cx1胚狀體誘導率。

關鍵詞：菜心;小孢子培養;胚狀體

中圖分類號：S634.5 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2020）07-034-05

Abstract：In order to optimize microspore culture system of flowering Chinese cabbage， 10 cultivars of Brassica campestris L. ssp. chinensis L. var. utilis Tsen et Lee were used for microspore culture. The effects of genotypes， different culture medium and plant growth regulator on microspore embryogenesis were studied. The results showed that genotype were one of the greatest effects on embryos induction rate， the induction frequencies of embryo were extremely different in the same culture condition， ‘Cx1，‘Cx6，‘Cx8was easier to obtain embryos， but the other materials did not obtain embryos. The induction rate of embryos was between 0-2.10 embryoid each bud due to the difference of genotypes. Same genotype under the condition of different medium components， especially the addition of activated carbon had the greatest effect on the induction rate of embryos， between 0.03-2.10 embryoid each bud. When sucrose concentration was 130 g·L-1 in the culture medium， the embryo induction rate of microspore culture was the highest. Furthermore， the rate of embryos induction of ‘Cx1was significantly increased by adding 0.05 mg·L-1 6-BA and 0.5 mg·L-1 NAA to the medium.

Key words： Flowering Chinese cabbage; Microspore culture; Embryoid

菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis L. var. utilis Tsen et Lee）又稱菜薹，在廣東省分布廣、栽培面積大、復種指數也比較高，近幾年在河南、寧夏、廣西、福建、海南等地也有大面積的種植。菜心是河南省供港蔬菜基地出口的重要蔬菜種類之一，在西華、安陽、滎陽、許昌等地都有大規模種植，帶動了周邊農民增收致富[1]。但是菜心種質資源匱乏，適宜多地種植的優良菜心品種不多，因此選育優質、抗病、抗逆、整齊度高的菜心雜種一代新品種（組合）具有重大的生產推廣價值和龐大的消費市場。

目前生產應用上主要以系統選育育成的常規品種為主[2-3]，而現代生物育種技術——小孢子培養技術目前已經在十字花科蕓薹屬多種蔬菜作物上有了應用[4-8]，并且利用所獲得的小孢子再生植株（DH系）快速高效地培育出了多個新品種[9-11]。在菜心利用小孢子培養技術研究上，朱允華等[12]和曾小玲等[13]發表了一些有關報道，但由于菜心出胚困難及出胚少的緣故，試驗獲得的正常胚狀體和再生植株數量有限，遠遠不能滿足菜心育種工作中所需要的純系植株。因此，在此基礎上完善菜心游離小孢子培養體系，培育菜心不同類型的優良DH系對接下來進一步選育優質高產、整齊一致的菜心新品種或新種類至關重要，不僅是解決菜心自交退化的關鍵，與此同時也可解決雄性不育系選育工作中遇到的一些困難。故在前人大量的研究報道和育種成果基礎上，筆者以收集的10種不同基因型菜心種質資源為試材，從基因型、蔗糖、活性炭和植物生長調節劑等4方面來探討，以期優化菜心小孢子培養體系，創制出多樣性的菜心DH系，選出育種可利用的優異DH系，配制雜交組合，應用到菜心雜種優勢育種實踐中。

1 材料和方法

1.1 材料

供試驗使用的10份材料編號為‘Cx1‘Cx2‘Cx3‘Cx4‘Cx5‘Cx6‘Cx7‘Cx8‘Cx9‘Cx10，由河南省農業科學院園藝研究所葉類蔬菜研究室、廣州金穗種業有限公司提供。2019年8月上中旬播種于河南現代農業研究開發基地，2019年10月初植株開花后取材進行小孢子培養，該試驗在河南省農科院園藝研究所完成。

1.2 方法

1.2.1 游離小孢子培養方法 選取無病蟲害、無裂蕾的花序，根據試驗需求選取適量的材料放置試驗袋中，噴水后放至4 ℃冰箱里低溫預處理24 h，當花蕾長度在2.1～2.5 mm之間時，進行小孢子培養。提取小孢子應選取花蕾的標準為：剝開花蕾后花瓣應位于花藥1/2～2/3的位置處。將挑選好的花蕾用75%的酒精和1%的次氯酸鈉溶液分別消毒30 s和15 min，最后用經過高壓滅菌的超純水清洗3遍，每次5 min。

Keller液體培養基作為洗液。第一步：將消過毒的花蕾夾到研磨管底部，加入2～3 mL沖洗液，研磨使花蕾中的小孢子分離出來;第二步：將研磨好的溶液倒入過濾網漏斗中過濾，確保將研磨的濾液完全滴入有刻度的離心管中，加入沖洗液定容至10 mL，蓋上離心管蓋并且用封口膜封緊管口防止溶液溢出，離心機中800 r·min-1離心3 min，倒出上層清液，只留下底部小孢子懸浮液;第三步：分別加入培養液至8 mL、6 mL并重復上述步驟。將以上步驟獲得的小孢子溶液加入NLN培養液至一定的刻度并攪拌均勻，分別加入2 mL到已加入適量培養液的培養皿中;使用封口膜將培養皿封嚴封緊不留空隙，培養皿放置在32～33 ℃的光照培養箱中處理24 h后，25 ℃暗培養條件下進行培養。在培養期間定期觀察培養皿中小孢子生長情況，至20 d左右統計并記錄出胚數目。

1.2.2 配制培養基 Keller液體培養基作為洗液。采用PhytotechbNLN培養基加入瓊脂，蔗糖和蒸餾水。用蒸餾水定容至所需體積，使用pH酸度計來調節沖洗液和NLN培養基的pH值均為5.8。沖洗液需要使用高壓鍋進行滅菌（121 ℃，20 min），NLN培養液則需要使用過濾器經過0.22 ?m的微孔濾膜過濾滅菌至無菌大三角瓶中，且以每瓶25～30 mL的體積分裝NLN培養液（過程嚴格要求無菌環境，以免受污染）。根據試驗設計添加不同濃度的生長調節劑、蔗糖、活性炭等，配制6種不同的培養基，分別編號為N0、N1、N2、N3、N4、N5。

N0：NLN+12%蔗糖+0.5 g·L-1活性炭;N1：NLN+10%蔗糖;N2：NLN+13%蔗糖;N3：NLN+15%蔗糖;N4：NLN+13%蔗糖+0.5 g·L-1活性炭;N5：NLN+13%蔗糖+0.5 g·L-1活性炭+0.05 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA。

1.2.3 影響菜心小孢子出胚率相關因素的試驗設計 主要有以下幾項。

（1）菜心不同基因型小孢子出胚情況比較分析：將試材在N0培養基進行小孢子培養，每個試材取30個花蕾，分別培養12皿，待20 d后觀察各個基因型胚狀體誘導情況，分析它們之間出胚率差異。

（2）蔗糖質量濃度對菜心小孢子胚發生能力的影響：選取符合試驗的基因型材料‘Cx1，對其進行3組處理，第1組用N1培養液處理，其中蔗糖質量濃度為100 g·L-1，第2組用N2培養液處理，其中蔗糖質量濃度為130 g·L-1，第3組用N3培養液處理，其中蔗糖質量濃度為150 g·L-1，每組處理12皿，記錄與分析三者之間的出胚數目和差異。

（3）活性炭對菜心小孢子胚發生能力的影響：選取基因型材料‘Cx1進行試驗，一組用N4培養基，另一組用不添加活性炭的N2培養基，每組處理培養12皿，在相同的操作步驟及生長壞境等條件下進行無菌培養，統計出胚情況。

（4）培養基中添加植物生長調節劑對菜心小孢子胚發生能力的影響：對同一菜心材料‘Cx1分別用添加和不添加植物生長調節劑培養基培養，將其進行2組不同處理，一組用添加0.05 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1 NAA的N5培養基，另一組用N4培養基，期間隨時觀察各個培養皿的胚狀體形成情況，統計出胚數據。

1.3 數據分析

采用SPSS 16.0軟件處理數據，單因素隨機區組試驗，Duncans新復極差測驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同基因型與出胚率的的關系

選取10種不同基因型的菜心品種，用N0培養基培養，出胚情況如表1。

由表1可以看出，試驗對比的 10種不同基因型菜心的小孢子在相同的培養基、操作步驟及生長壞境等條件下進行無菌培養，其中‘Cx1‘Cx6‘Cx8材料獲得了胚狀體，而‘Cx2‘Cx3‘Cx4‘Cx5‘Cx7‘Cx9‘Cx10材料則沒有得到胚狀體，其中基因型‘Cx1獲得的胚狀體數目最多，出胚率為2.10胚·蕾-1，出胚最少的基因型‘Cx6的出胚率僅為0.10胚·蕾-1，兩者相差20倍。因此可以看出，不同基因型的材料之間小孢子胚狀體出胚率差異較大，而且基因型與小孢子胚誘導發生能力有著緊密聯系。

2.2 蔗糖對菜心小孢子胚發生能力的影響

由表2可以看出，N2培養基中蔗糖質量濃度（130 g·L-1）較高于N1培養基中的蔗糖質量濃度（100 g·L-1），其出胚率1.93胚·蕾-1也高于N1培養基中的出胚率0.97胚·蕾-1，且前者是后者的1.99倍。當培養基中蔗糖質量濃度增加至150 g·L-1時，‘Cx1的小孢子出胚率顯著降低，僅為0.07胚·蕾-1，與出胚率最高的相差26倍多。由上可得，對于同一基因型材料進行小孢子培養時，添加適宜的蔗糖質量濃度可顯著提高胚狀體誘導率，而當添加濃度過高時，其胚胎發生能力則大大降低，胚狀體誘導率呈明顯下降趨勢。說明蔗糖質量濃度的高低在一定程度上會嚴重影響菜心游離小孢子培養的胚狀體誘導率。

2.3 活性碳對菜心小孢子胚發生能力的影響

由表3可以看出，活性炭對‘Cx1菜心小孢子的出胚率有一定的影響，以下小孢子材料操作培養條件相同的情況下，培養基中加入活性炭的小孢子出胚率較高，培養基中不加活性炭的小孢子出胚率則較低。‘Cx1添加活性炭之后的出胚率為2.10 胚·蕾-1，而不加炭的出胚率僅為0.20 胚·蕾-1，兩者之間的出胚率相差近10倍。試驗結果說明，對于同一基因型進行小孢子培養，在培養基中添加少量的活性炭有助于提高小孢子出胚率，因此對于其他不易出胚的基因型材料在小孢子培養過程中可添加適量活性炭來促進誘導胚胎發生能力。

2.4 植物生長調節劑對菜心小孢子胚發生能力的影響

將基因型材料‘Cx1分別用添加（N5）和不添加（N4）植物生長調節劑培養基培養，由表4可以看出，其他操作條件均相同的情況下使用同一基因型材料，在培養基中添加0.05 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1 NAA之后‘Cx1的出胚率為 2.13胚·蕾-1，而不添加植物生長調節劑時其出胚率為0.27 胚·蕾-1，兩者出胚率相差6.89倍。可知，在‘Cx1菜心小孢子培養過程中添加6-BA和NAA激素組合可以顯著提高小孢子出胚率，從而使獲得子葉型胚狀體的概率變大。

3 討論與結論

基因型是制約小孢子發育的重要因素，同樣對不同基因型菜心小孢子培養的胚胎發生能力也有明顯影響。本試驗中不同基因型材料之間小孢子胚胎發生率不盡相同，在10份試材中僅有3份成功獲得了胚狀體，且各個基因型之間出胚率差異較大，其余7份材料經多次試驗培養后也未能獲得正常的胚芽，這一試驗結果在紅菜薹[14-15]、大白菜[16]和花椰菜[17]等多個蕓薹屬蔬菜作物小孢子培養中均有類似報道。有學者利用菜心和芥藍種間雜交提高后代親和性，可擴大基因型范圍，提高一些難成胚基因型的出胚能力[18]，而這一方法陳文輝等[19]在甘藍上已經獲得了成功。此外，利用快速加代技術可不受基因型的限制直接獲得純系[20]，在實際試驗工作中，可將其與小孢子培養技術結合使用，來減少和克服因基因型差異而導致的小孢子培養試驗中不出胚或出胚少的問題。

在小孢子培養過程中，培養基中的蔗糖是保證小孢子正常發育的主要能量來源，還可調節滲透壓，為小孢子胚胎發育營造有利的生長環境，在多種蕓薹屬蔬菜作物小孢子培養中已多有研究和討論[21-23]。Zhang wei等[21]報道在13%和16%的蔗糖質量濃度下進行小孢子培養均可獲得羽衣甘藍小孢子胚狀體。曾小玲等[13]試驗得出，在菜心小孢子培養第1天時先使用170 g·L-1高質量濃度的蔗糖培養之后再轉化成130 g·L-1的蔗糖質量濃度進行培養，可使其胚誘導頻率顯著提高，尤其對難出胚的基因型材料而言。在本試驗中設計了100 g·L-1、130 g·L-1和150 g·L-1的蔗糖質量濃度梯度進行比較試驗，結果得出材料‘Cx1在130 g·L-1濃度下進行小孢子培養時，獲得胚狀體誘導率最高，達1.93胚·蕾-1，而蔗糖質量濃度過低或過高時，小孢子生長發育成為胚狀體的效率都有所下降，尤其蔗糖質量濃度過高時，其胚胎發生率呈明顯下降趨勢。

活性炭在小孢子培養中的重要作用早已被證實[24-25]，但并非對所有基因型材料都有促進作用。國外學者[26]研究了活性炭對多種不同基因型甘藍類蔬菜作物小孢子培養的影響，得出在培養基中添加1%的活性炭可顯著提高甘藍類蔬菜小孢子胚胎發生率，這與本試驗的研究結果一致。而劉雪平等[27]研究結果表明，在培養基中添加一定濃度的活性炭對甘藍型油菜小孢子胚狀體形成并無明顯促進作用。

植物生長調節劑的添加對于小孢子生長發育、細胞分裂與生長途徑具有重要作用。NLN培養基中添加一定量的6-BA和NAA可以使胚狀體誘導率顯著提高，這在紅菜薹[14]、白菜[22]、蕪菁[28]和小菘菜[29]等多種蕓薹屬蔬菜作物中均有相關報道，但2種激素的適宜使用濃度和配比在不同蕓薹屬蔬菜或相同作物不同基因型材料中有明顯差異。施柳等[30]試驗得出，添加0.3 mg·L-1 6-BA可使大白菜小孢子出胚率顯著提高，而趙大芹等[31]研究表明，在黔白大白菜雜交種小孢子培養過程中使用0.05 mg·L-1 6-BA和0.10 mg·L-1 NAA濃度組合時，其胚胎發生率和成熟胚的比例最高。于文佳等[29]也認為，在小菘菜小孢子培養中添加0.05 mg·L-1 6-BA和0.20 mg·L-1 NAA所獲得的出胚率要明顯高于不添加激素的對照。基于前人的試驗探究結果，筆者在菜心小孢子培養基中添加0.05 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1NAA可以顯著提高‘Cx1的出胚率，此試驗結果與曾小玲等[13]的研究結論相似。

除常見的6-BA、NAA和KT等植物生長調節劑在小孢子培養中應用較多且應用效果顯著外，國內外多數學者也逐漸把在其他作物上有助于提高胚胎發生能力和促進細胞分裂生長的添加劑或激素應用到了蔬菜作物小孢子培養試驗上，并且在一些試材上已經獲得了成功。黃天虹等[32]在不結球白菜小孢子培養中發現，添加一定濃度的頭孢噻胯可提高部分基因型材料的出胚率;Gao等[33]研究發現，在NLN-13培養基中添加0.000 1%的非離子型表面活性劑可使紫菜薹小孢子胚胎發生率和植株再生率顯著提高，且獲得雙單倍體植株達60%以上。前人的大量報道和本研究的試驗結果可為菜心和其他作物進行小孢子培養試驗提供有力的參考依據和思路。

參考文獻

[1] 王志勇.河南省蔬菜產業發展現狀及對策[J].現代農業科技，2012，40（1）：345-346.

[2] 張衍榮.菜心育種現狀與展望[J].廣東農業科學.1997，24（3）：15-16.

[3] 李光光，張華，黃紅弟，等.廣東省菜薹（菜心）育種研究進展[J].中國蔬菜，2011（20）：9-14.

[4] 王超楠，聞鳳英，劉曉暉，等.球莖甘藍小孢子培養中影響胚誘導的幾個因素[J].中國蔬菜，2010（10）：35-39.

[5] 喬麗桃.蕪菁游離小孢子培養及其胚胎發生的研究[D].烏魯木齊：新疆農業大學，2014.

[6] 軒正英，徐書法，馮輝.大白菜游離小孢子培養成胚影響因素的研究[J].遼寧農業科學，2005（2）：18-19.

[7] 秦艷梅，王明霞，江海坤，等.安徽烏菜游離小孢子培養及植株再生體系建立[J].長江蔬菜，2017，（6）：29-31.

[8] 張振超，耿鑫鑫，戴忠良，等.甘藍類植物小孢子培養及植株再生研究[J].核農學報.2013，27（7）：929-937.

[9] 耿建峰，原玉香，張曉偉，等.利用游離小孢子培養技術育成抗熱大白菜新品種‘豫園50[J].園藝學報，2002，29（1）：89-97.

[10] 宋立曉，曾愛松，高兵，等.青花菜新品種蘇青3號的選育[J].江蘇農業科學，2014，42（12）：216-218.

[11] 曾愛松，高兵，宋立曉，等.秋季專用牛心甘藍新品種錦秋55的選育[J].江蘇農業科學，2015，43（11）：230-231.

[12] 朱允華，劉明月，吳朝林.影響菜心游離小孢子培養的因素[J].長江蔬菜，2003（9）：46-47.

[13] 曾小玲，方淑桂，朱朝輝，等.不同基因型菜心游離小孢子培養和植株再生[J].熱帶作物學報，2014，35（12）：2397-2402.

[14] 吳藝飛，丁茁荑，肖杰，等.紅菜薹小孢子培養技術研究進展[J]. 長江蔬菜，2013，（24）：5-8.

[15] 肖輝，徐躍進，李正麗.紅菜薹游離小孢子培養的影響因素研究[J].安徽農業科學，2008，36（17）：7240-7241.

[16] TAKAHASHI Y，YOKOI S，TAKAHATA Y.Effects of genotypes and culture conditions on microspore embryogenesis and plant regeneration in several subspecies of Brassica rapa L.[J].Plant Biotechnology Reports，2012，6（4）：297-304.

[17] 趙前程，吉立柱，蔡榮旗，等.花椰菜游離小孢子培養及植株再生研究[J].華北農學報，2007，22（6）：65-68.

[18] 魏云曉，李菲，張淑江，等.菜薹（菜心）—芥藍雜交親和性分析及后代性狀表現[J].中國蔬菜，2017（11）：21-27.

[19] 陳文輝，方淑桂，曾小玲，等.甘藍和青花菜雜種小孢子培養[J]. 熱帶亞熱帶植物學報，2006，14（4）：321-326.

[20] 孔曜.菜心快速加代技術研究及加代后代DNA位點純合率鑒定[D].廣州：廣州大學，2017.

[21] ZHANG W，FU Q，DAI X，et.al.The culture of isolated microspores of ornamental kale （Brassica oleracea var. acephala） and the importance of genotype to embryo regeneration [J]. Scientia Horticulturae，2008，117（1）：69-72.

[22] 唐兵，陶蓮，盧松，等.白菜游離小孢子培養高頻胚誘導技術體系優化[J].熱帶作物學報，2017，38（10）：1913-1920.

[23] 張曉芬，王曉武，張延國，等.花椰菜游離小孢子培養再生植株研究[J].中國蔬菜，2005（1）：l6-l7.

[24] 饒勇，徐涵，毛堂芬，等.單倍體育種技術在油菜育種材料創新上的應用研究Ⅰ.甘藍型油菜游離小孢子胚狀體的誘導發生[J].種子，2003（1）：66-67.

[25] 曹鳴慶，李巖，蔣濤，等.大白菜和小白菜游離小孢子培養試驗簡報[J].華北農學報，1992，7（2）：119-120.

[26] JO?O CARLOS DA SILVA DIAS.Effect of activated charcoal on Brassica oleracea microspore culture embryogenesis[J].Euphytica，1999，108（1）：65-69.

[27] 劉雪平，劉志文，涂金星，等.甘藍型油菜小孢子培養技術的幾項改進[J].遺傳，2003，25（4）：433-436.

[28] 軒正英，馬國財.新疆蕪菁小孢子培養成胚影響因素研究[J].湖北農業科學，2017，56（13）：2540-2542.

[29] 于文佳，侯喜林，趙曉嫚，等.小菘菜游離小孢子培養和植株再生[J].南京農業大學學報，2013，36（2）：7-12.

[30] 施柳，王雅瓊，李云龍，等.不同基因型大白菜小孢子胚狀體誘導及植株再生[J].北方園藝.2014，38（6）：101-104.

[31] 趙大芹，陶蓮，張朝君，等.培養基成分對黔白大白菜雜交種小孢子胚誘導的影響[J].貴州農業科學，2007，35（6）：24-25.

[32] 黃天虹，張婭，梁超凡，等.不結球白菜游離小孢子培養及植株再生研究[J].核農學報，2019，33（2）：240-247.

[33] GAO Y M，JIA J X， CONG J L，et.al.Non-ionic surfactants improved microspore embryogenesis and plant regeneration of recalcitrant purple flowering stalk （Brassica campestris ssp. chinensis var. purpurea Bailey）[J].In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant，2020，56（2）：207-214.