清開靈注射液對腦缺血大鼠急性期病理形態(tài)學(xué)、炎癥因子及凋亡基因Bcl-2和p53表達(dá)的影響?

單潔齡 李志強(qiáng) 吳書菊△

（1.上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院，上海 200125；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021）

缺血性腦血管病是世界范圍內(nèi)常見的高危疾病，約占腦血管疾病的70%～80%，是因腦部血液循環(huán)障礙引發(fā)缺血、缺氧，導(dǎo)致局部腦組織變性壞死，腦組織受損［1］。腦缺血在發(fā)生和發(fā)展中多伴有炎癥反應(yīng)，在急性期尤為明顯。凋亡是腦缺血神經(jīng)元死亡的主要方式，是目前腦缺血機(jī)制研究的熱點(diǎn)。目前研究認(rèn)為，Bcl-2和p53是最重要的調(diào)控基因［2］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為急性期腦缺血的機(jī)制為痰瘀互結(jié)、兼夾氣血不足、脾胃升降失調(diào)，所致腦脈不通，治宜活血醒腦開竅［3-4］。清開靈注射液具有清熱解毒、化痰通絡(luò)、醒神開竅之功效，用于治療熱病神昏、中風(fēng)偏癱、神志不清等腦血管病，具有較好的臨床療效［5］，但其作用機(jī)制研究尚不明確。本研究旨在觀察清開靈注射液對腦缺血模型大鼠急性期的腦組織病理學(xué)、炎癥因子及腦細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響，旨在為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

60只SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，購于上海邦耀生物科技有限公司，動物許可證號：SYXK（滬）2018-0034。置于（23±2）℃室溫中，晝夜節(jié)律，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)環(huán)境7 d后于9∶00～17∶00進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與儀器

清開靈注射液（廣州白云上制藥有限公司，批號181205）；尼莫地平注射液（上海信誼金朱藥業(yè)有限公司，批號190407）；水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），蘇木素和伊紅以及TTC（Sigma公司）、BCA蛋白定量試劑盒和trizol試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、兔p53和Bcl-2抗體（Sigma公司），PCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；免疫組組織化學(xué)試劑盒購于凋亡試劑盒和DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；GAPDH抗體購與Cell Signaling Technology公司；PBS緩沖液和二抗由碧云天生物技術(shù)研究所提供；其他試劑均為分析純購于天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉注射液（批號07112133）由山東康寧藥業(yè)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 分組與造模

將評分相近的60只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組15只，即假手術(shù)組、模型組、陽性組和實(shí)驗(yàn)組。參考文獻(xiàn)［6］制備腦缺血大鼠模型，將除假手術(shù)組外的大鼠，采用水合氯麻醉，俯臥固定于手術(shù)臺，采用改良線栓法制作腦缺血大鼠模型，分組分籠飼養(yǎng)，不禁食水。假手術(shù)組大鼠僅用玻璃分針游離出雙側(cè)頸總動脈不做結(jié)扎處理。造模成功后7 d，陽性組給予尼莫地平注射液10 mg/kg腹腔注射；實(shí)驗(yàn)組給予清開靈注射液50 mg/kg腹腔注射，對照組和模型組均給予同體積的0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，連續(xù)7 d。

1.4 神經(jīng)功能評分 采用BBB運(yùn)動功能評分［7］評價運(yùn)動功能，于術(shù)后7 d后對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分并記錄結(jié)果，分為各關(guān)節(jié)活動能力、后肢步態(tài)及協(xié)調(diào)能力以及運(yùn)動過程中爪的精細(xì)動作等3部分，共21分，評分越高運(yùn)動功能越理想。采用Garcia評分法［8］對各組大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評分，總分計(jì)3～18分，得數(shù)越低，損傷程度越重。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

1.5.1 腦組織梗死情況及神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測 造模7 d后，頸椎脫臼法處死大鼠后迅速剝?nèi)∧X組織，置于-20℃冰箱中15 min。取出腦組織，剝離海馬CA1區(qū)，0.9%氯化鈉注射液清洗，固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片。取切片置于2%TTC染色液中染色，避光孵育30 min，10%甲醛固定，通過經(jīng)圖像分析系統(tǒng)測量腦梗死面積。其中梗死的腦組織呈白色，正常的腦組織為紅色。取切片脫蠟脫水，置于TUNEL試劑盒反應(yīng)液和復(fù)合液中進(jìn)行DAB顯色，蘇木素染色5 min后封片，陰性對照置于蒸餾水中，顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，選取5個400倍視野分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目。

1.5.2 炎癥因子的測定 7 d后收集3 mL腹動脈血液，離心，分離血清，ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）以及白介素-18（IL-18）炎癥因子水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5.3 凋亡基因測定 稱取200 mg腦組織進(jìn)行樣品制備，trizol法提總RNA，取1 g總RNA進(jìn) 行逆轉(zhuǎn)錄cRNA合成，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和相關(guān)引物的說明書加入相應(yīng)量的試劑進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用全自動數(shù)碼凝膠分析儀檢測目的cRNA。BCA法測定蛋白濃度，Western blotting檢測Bcl-2表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)法檢測p53表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 RT-PCR相關(guān)參數(shù)

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)比較組內(nèi)和組間差異；計(jì)數(shù)資料以（%）表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和神經(jīng)行為學(xué)評分比較

見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的BBB評分和神經(jīng)功能評分明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）。給予藥物干預(yù)后，陽性組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的BBB評分和神經(jīng)功能評分明顯高于模型組（P＜0.05），兩組大鼠的BBB評分和神經(jīng)功能評分間比較均有顯著性差異（P＜0.05）。

表2 各組大鼠的BBB評分和神經(jīng)功能評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠的BBB評分和神經(jīng)功能評分比較（分，±s）

與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組陽性組實(shí)驗(yàn)組n 10 10 10 10 BBB評分19.40±2.04 8.27±1.34*13.14±0.81*#15.62±0.76*#神經(jīng)功能評分16.50±2.00 8.08±1.21*12.08±1.19*#14.25±0.92*#

2.2 各組大鼠腦組織梗死體積及神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較

見表3。假手術(shù)組大鼠的腦組織細(xì)胞未見明顯病理改變、神經(jīng)元排列緊密整齊，核仁明顯可見，居中，細(xì)胞膜清晰。模型組腦組織神經(jīng)元明顯減少，結(jié)構(gòu)模糊構(gòu)型紊亂，不規(guī)則出現(xiàn)不同程度變性壞死及炎細(xì)胞浸潤、核體固縮深染；與模型組相比，陽性組和實(shí)驗(yàn)組的神經(jīng)元均明顯增多，有不同程度的緩解恢復(fù)，核固縮核體均有不規(guī)則程度的減輕，間質(zhì)水腫減輕，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，見圖1～圖2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的腦梗死體積和神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯升高（P＜0.05），給予藥物治療后，陽性組和實(shí)驗(yàn)組的腦梗死體積和神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平明顯降低（P＜0.05），兩組間比較均有顯著性差異（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腦梗死體積及神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較（±s）

表3 各組大鼠腦梗死體積及神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組陽性組實(shí)驗(yàn)組n 15 15 15 15腦梗死體積（%）0.00±0.00 45.37±4.38*32.03±5.01*#33.95±3.96*#神經(jīng)細(xì)胞凋亡（個）11.12±1.87 65.28±7.26*30.98±3.42*#32.15±4.05*#

圖1 各組大鼠的腦組織病理圖（TTC，400倍）

圖2 各組大鼠的腦組織梗死面積比較

2.3 各組大鼠炎癥因子水平比較

見表4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-18水平明顯升高（P＜0.05）。給予藥物干預(yù)后，陽性組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的炎癥因子水平明顯降低（P＜0.05），兩組大鼠的炎癥因子比較有顯著性差異（P＜0.05）。

表4 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表4 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

與陽性組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組陽性組實(shí)驗(yàn)組n 15 15 15 15 TNF-α 45.89±6.16 124.75±12.08*75.09±9.14*#64.28±7.32*#△IL-1β 34.53±4.67 106.72±13.85*64.66±7.54*#55.69±6.71*#△IL-6 26.12±2.67 78.47±7.86*50.57±4.45*#42.87±3.09*#△IL-18 23.14±2.59 61.23±6.12*40.47±5.74*#35.12±3.26*#△

2.4 各組大鼠凋亡基因Bcl-2和p53表達(dá)比較

見表5，圖3。與假手術(shù)組比較，Bcl-2基因表達(dá)和Bcl-2蛋白表達(dá)的相對豐度值明顯降低，具有顯著差異（P＜0.05），模型組大鼠的凋亡基因p53基因表達(dá)和p53蛋白表達(dá)的相對豐度值明顯升高（P＜0.05）。給予藥物干預(yù)后，Bcl-2基因表達(dá)和Bcl-2蛋白表達(dá)的相對豐度值明顯高于模型組（P＜0.05），陽性組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的p53基因表達(dá)和p53蛋白表達(dá)的相對豐度值明顯低于模型組，兩組比較均有顯著性差異（P＜0.05）。

表5 各組大鼠凋亡基因Bcl-2和p53表達(dá)比較（分，±s）

表5 各組大鼠凋亡基因Bcl-2和p53表達(dá)比較（分，±s）

組別假手術(shù)組模型組陽性組實(shí)驗(yàn)組n 15 15 15 15 Bcl-2基因表達(dá)0.86±0.15 0.21±0.06*0.68±0.18*#0.73±0.10*#△蛋白表達(dá)的相對豐度值0.97±0.11 0.39±0.09*0.74±0.12*#0.87±0.17*#△p53基因表達(dá)1.21±0.16 15.37±1.38*9.53±1.11*#8.72±1.52*#△蛋白表達(dá)的相對豐度值0.33±0.14 1.12±0.07 0.78±0.10*#0.62±0.09*#△

圖3 各組大鼠的凋亡相關(guān)蛋白電泳條帶

3 討 論

腦缺血病理生理變化與炎癥因子及氧自由基大量產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的啟動等多方面因素密切相關(guān)［9］。神經(jīng)功能和神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)對腦缺血疾病的研究具有重要作用，可真實(shí)反映腦缺血疾病程度。炎癥在腦缺血病程進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，腦缺血可打破促炎和抗炎反應(yīng)間的動態(tài)平衡，且炎癥標(biāo)志物水平與預(yù)后不良密切相關(guān)［10-11］，研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血的炎癥反應(yīng)是一個動態(tài)過程，腦部缺血中心區(qū)的壞死組織因大量的炎癥介質(zhì)及炎癥因子的釋放，激活免疫應(yīng)答，加重炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)釋放大量的氧自由基、一氧化氮、興奮性氨基酸等毒性物質(zhì)，相互作用明顯造成腦組織不可逆的損傷，可誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腦細(xì)胞凋亡甚至壞死，加重腦損傷［12］。TNF-α是炎癥反應(yīng)的起始因子，具有多效促炎性及神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，致使內(nèi)皮細(xì)胞屏障的滲透性增加［13］。IL-1β是腦缺血狀態(tài)下由星形膠質(zhì)細(xì)胞等大量分泌而成的，參與炎癥級聯(lián)擴(kuò)大反應(yīng)，是腦缺血早期炎癥反應(yīng)的重要炎癥因子，是腦缺血損傷的病理生理基礎(chǔ)。而且IL-1β的激活會促進(jìn)TNF-α分泌，同時二者會增加其他炎癥因子表達(dá)，導(dǎo)致腦損傷程度加重。IL-6為炎癥遞質(zhì)，可加重腦缺再灌注的全身反應(yīng)和局部損傷。IL-18參與了急性腦損傷的病理生理過程，且其血清中含量與腦損傷程度密切相關(guān)，對于臨床診斷預(yù)后判斷和提高患者救治水平有重要意義［14］。細(xì)胞凋亡是指機(jī)體受刺激后一系列基因參與的細(xì)胞自主有序的程序性死亡，Bcl-2、P53等是細(xì)胞凋亡啟動的關(guān)鍵。Bcl-2為高度同源蛋白中的經(jīng)典的抗凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，在調(diào)控細(xì)胞自噬的過程中也有重要作用［15］。此外，Bcl-2還能調(diào)控氧化應(yīng)激誘導(dǎo)自噬和凋亡［16］。p53作為轉(zhuǎn)錄因子可通過調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋，是調(diào)控的凋亡蛋白中的重要成員之一［17］。

腦缺血屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，痰瘀互結(jié)、腦脈不通為病機(jī)，氣血、脾胃升降失調(diào)，治宜活血醒腦開竅。清開靈注射液方中水牛角粉清熱定驚、涼血解毒、為君藥。膽酸、豬去氧膽酸清熱解毒、息風(fēng)止痙、開竅豁痰；梔子、板藍(lán)根、黃芩、金銀花清熱解毒，燥濕瀉火，共為臣藥。佐以珍珠母清心肝之火而明目。諸藥相合，共奏清熱解毒、化痰通絡(luò)、醒神開竅之功。現(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)［18-20］，水牛角有明顯的抗炎作用，可用于炎癥性疾病的治療；黃芩苷可通過調(diào)控線粒體自噬減輕胞神經(jīng)元細(xì)胞缺血缺氧再灌注損傷；梔子中的活性成分梔子苷和西紅花苷I，可通過改善線粒體的能量代謝抗氧化抗炎抑制細(xì)胞凋亡等途徑在腦缺血的治療中發(fā)揮作用，而且黃芩苷梔子苷配伍可通過抑制興奮性氨基酸的釋放而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的神經(jīng)功能評分、神經(jīng)行為學(xué)評分明顯降低，大鼠的腦組織神經(jīng)元明顯減少，結(jié)構(gòu)模糊構(gòu)型紊亂，不規(guī)則出現(xiàn)不同程度變性壞死及炎細(xì)胞浸潤、核體固縮深染，腦梗死體積、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL18水平。給藥后，陽性組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的神經(jīng)元均明顯增多，有不同程度的緩解恢復(fù)，核固縮核體均有不規(guī)則程度的減輕，間質(zhì)水腫減輕，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，神經(jīng)功能評分和神經(jīng)行為學(xué)評分明顯升高，腦梗死體積、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎癥因子水平明顯低于模型組，提示清開靈注射液能有效地提高腦缺血大鼠的神經(jīng)功能和神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)，減少腦梗死體積和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，降低炎癥因子水平。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦部Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)，p53表達(dá)顯著上調(diào)。給予藥物干預(yù)后，陽性組和實(shí)驗(yàn)組的大鼠腦部Bcl-2蛋白水平顯著上調(diào)，p53表達(dá)顯著下調(diào)，提示清開靈注射液能有效地調(diào)整凋亡相關(guān)因子表達(dá)，減少腦部細(xì)胞的死亡，激活腦細(xì)胞自我保護(hù)。

綜上所述，清開靈注射液對腦缺血模型大鼠可有效地減少腦梗死面積，保護(hù)腦組織免受炎癥因子的損傷，調(diào)整凋亡相關(guān)因子表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，激活腦細(xì)胞自我保護(hù)。