沒食子酸在Caco-2細胞模型中的吸收轉運研究

程珍珍，周本宏,，姜 姍，金 丹

(1.武漢大學藥學院，湖北 武漢 430072；2.武漢大學人民醫院藥學部，湖北 武漢 430060)

石榴皮是石榴科植物石榴PunicagranatumL.的干燥果皮，是一種常見的中藥，具有止血、驅蟲、澀腸止瀉的功效[1]。沒食子酸是石榴皮中沒食子鞣質的重要生物活性成分之一，是結構最為簡單的天然多酚物質[2]。沒食子酸具有抗肝纖維化、抗糖尿病、抗腫瘤等作用[3-4]。Caco-2細胞是來源于人類結腸直腸癌，Caco-2細胞模型被廣泛地用于評估藥物腸道吸收特征和研究藥物的轉運吸收[5-6]。目前對沒食子酸的吸收轉運機制及其影響轉運的因素研究甚少。因此，本研究建立Caco-2細胞模型，對沒食子酸的轉運吸收方式以及影響因素進行研究，以初步闡明沒食子酸吸收轉運機制。

1 材料和方法

1.1 材料沒食子酸對照品(成都曼斯特，批號：16022801，純度99%);細胞 Caco-2細胞株，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，代數在35～50代。

1.2 色譜條件色譜柱：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相：有機相甲醇(A)，水相0.1%磷酸(B)，A ∶B=3 ∶7等度洗脫；流速，1.00 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量20 μL檢測波長，273 nm。

1.3 細胞毒性實驗采用CCK-8法；計算細胞存活率。

1.4 轉運實驗取培養21 d、TEER值大于500 Ω·cm-2、堿性磷酸酶與酚紅滲透率均達標的Caco-2細胞，進行轉運實驗。分別測定時間、溫度、pH值、P-糖蛋白抑制劑維拉帕米與環孢菌素對沒食子酸吸收轉運的影響。

1.5 數據處理表觀滲透系數( apparent permeability，Papp) 值和外排率(efflux ratio，ER)值。

式中：A為Transwell 小室的有效面積;ΔQ為Δt時間內藥物的累積轉運量;C0為藥物的初始濃度;Papp(BL-AP)為 BL到AP側的Papp值;Papp(AP-BL)為AP到BL側的Papp值。

2 結果

2.1 細胞毒性實驗如Tab 1，除了250 μmol·L-1外，其余濃度的存活率均超過95%，表明沒食子酸對Caco-2細胞沒有毒性。

Tab 1 ytotoxicity of gallic acid at different concentrations

2.2 不同時間藥物的累積轉運量沒食子酸的積累隨著濃度和時間的增加而增加，呈現出近似線性的關系，說明沒食子酸的膜吸收和轉運都涉及被動擴散。

2.3 濃度對藥物轉運的影響吸收的Papp(AP-BL)明顯大于排泄Papp(BL-AP)，說明當GA濃度高于一定值時，排泄機制被激活(P<0.05)。

2.4 溫度對藥物轉運的影響4 ℃時，Papp(AP-BL)和Papp(BL-AP)值顯著低于37 ℃(P<0.05)，說明溫度對沒食子酸的吸收有影響。

2.5 pH值對藥物轉運的影響沒食子酸在pH 6.0的Papp(AP-BL)值高于pH 7.4(P<0.05)，說明在pH 6.0時沒食子酸的轉運比在pH 7.4時更容易。

2.6 P-gp 抑制劑對藥物轉運的影響與對照組相比，P-gp抑制劑維拉帕米和環孢素A使沒食子酸的Papp(AP-BL)值顯著升高(P<0.05)，而Papp(BL-AP)值顯著降低(P<0.05)，說明沒食子酸可能是P-gp的底物。

3 討論

沒食子酸在Caco-2 細胞上的轉運方式以被動轉運為主。同時沒食子酸在 Caco-2細胞的轉運受濃度、溫度、pH值及P-gp抑制劑的影響，P-gp參與了沒食子酸的轉運。本研究初步闡明了沒食子酸在Caco-2細胞中的轉運機制及其影響因素，同時也為沒食子酸的進一步開發利用奠定了良好的實驗基礎。